Réalisation de quatre tests d'amplification d'acides nucléiques pour identifier le SARS-CoV-2 en Éthiopie

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Depuis l'épidémie de maladie à coronavirus (COVID-19) de 2019, de nombreux tests d'amplification des acides nucléiques (TAAN) commerciaux ont été développés dans le monde entier et sont devenus des tests standard. Bien que plusieurs tests aient été rapidement développés et appliqués aux tests de diagnostic en laboratoire, leurs performances n'ont pas été évaluées dans divers contextes. Par conséquent, cette étude visait à évaluer les performances des tests Abbott SARS-CoV-2, Daan Gene, BGI et Sansure Biotech à l'aide du standard de référence composite (CRS). L'étude a été menée à l'Institut éthiopien de santé publique (EPHI) du 1er au 30 décembre 2020. 164 échantillons nasopharyngés ont été extraits à l'aide du mini kit QIAamp RNA et du système de préparation d'échantillons d'ADN Abbott. Sur 164 échantillons, 59,1 % étaient positifs et 40,9 % étaient négatifs pour le CRS. La positivité de Sansure Biotech était significativement faible par rapport à CRS (p < 0,05). La positivité de Sansure Biotech était significativement faible par rapport à CRS (p < 0,05). Les résultats positifs de Sansure Biotech ont été très faibles en termes de CRS (p < 0,05). Les résultats positifs de Sansure Biotech étaient significativement inférieurs à ceux du CRS (p < 0,05).Pour CRS, Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0.05）。Pour CRS, Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0.05）。 Chez Sansure Biotech, il y a des résultats très élevés en matière d'évaluation du CRS (p < 0,05). Sansure Biotech a eu significativement moins de résultats positifs par rapport à CRS (p < 0,05).La concordance globale des quatre analyses était de 96,3 à 100 % par rapport au CRS. Outre le faible taux de positivité du test Sansure Biotech, les performances des quatre tests étaient quasiment comparables. Par conséquent, le test Sansure Biotech [Research Only (RUO)] nécessite une validation supplémentaire pour son utilisation en Éthiopie. Enfin, des recherches complémentaires devraient être envisagées pour évaluer les tests conformes aux déclarations du fabricant.
Les tests de laboratoire font partie du Plan stratégique de préparation et de riposte à la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) de l'Organisation mondiale de la Santé (OMS). L'OMS recommande aux pays de renforcer les capacités de leurs laboratoires afin d'améliorer leur préparation, la prise en charge adéquate des cas, la vigilance et la rapidité de réponse aux défis de santé publique. Cela suggère que le rôle des laboratoires est essentiel pour caractériser la maladie et l'épidémiologie des agents infectieux émergents, ainsi que pour contrôler leur propagation.
Français Le diagnostic de la COVID-19 nécessite des informations épidémiologiques et médicales, des symptômes/signes personnels et des données radiographiques et de laboratoire2. Depuis que l'épidémie de COVID-19 a été signalée à Wuhan, en Chine, de nombreux tests commerciaux d'amplification des acides nucléiques (TAAN) ont été développés dans le monde entier. La réaction en chaîne par polymérase par transcription inverse en temps réel (rRT-PCR) est utilisée comme méthode de routine et standard pour le diagnostic en laboratoire de l'infection par le syndrome respiratoire aigu sévère 2 (SARS-CoV-2)3. La détection moléculaire du SARS-CoV-2 est généralement basée sur les gènes N (gène de la protéine de la nucléocapside), E (gène de la protéine de l'enveloppe) et RdRp (gène de l'ARN polymérase dépendante de l'ARN) dans la région ORF1a/b (cadre de lecture ouvert 1a/b). gène) identifiée à partir du génome viral. Ils sont considérés comme les principales régions conservées trouvées dans les génomes viraux pour la reconnaissance du virus4. Parmi ces gènes, les gènes RdRp et E ont une sensibilité de détection analytique élevée, tandis que le gène N a une faible sensibilité analytique5.
Les performances des tests PCR peuvent varier en fonction de divers facteurs tels que les réactifs d'extraction, les réactifs d'amplification/détection, la méthode d'extraction, la qualité de la machine PCR et d'autres instruments. En avril 2020, plus de 48 dispositifs de diagnostic différents provenant de neuf pays avaient reçu une autorisation d'utilisation d'urgence (EUA) pour le diagnostic de la COVID-196. En Éthiopie, plus de 14 plateformes de PCR en temps réel sont utilisées pour la détection PCR du SARS-CoV-2 dans 26 établissements de santé publique, dont ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000 et Quant-studio7. De plus, divers kits de test PCR sont disponibles, tels que le test Daan Gene, le test Abbott SARS-CoV-2, le test Sansure Biotech et le test SARS-CoV-2 BGI. Français Bien que la rRT-PCR soit très sensible, certains patients atteints de COVID-19 rapportent des résultats faussement négatifs en raison d'un nombre insuffisant de copies d'acide ribonucléique (ARN) viral dans les échantillons en raison d'une collecte, d'un transport, d'un stockage et d'une manipulation inappropriés, ainsi que de tests de laboratoire. conditions et actions du personnel8. De plus, une mauvaise manipulation de l'échantillon ou du témoin, le réglage du seuil de cycle (Ct) et la réactivité croisée avec d'autres acides nucléiques pathogènes ou de l'ARN inactif/résiduel du SARS-CoV-2 peuvent entraîner des résultats faussement positifs dans les tests rRT-PCR9. Ainsi, il est clair que les tests PCR peuvent effectivement identifier les porteurs de fragments de gènes, car ils ne peuvent même pas faire la distinction entre les gènes viraux véritablement actifs, de sorte que les tests ne peuvent identifier que les porteurs et non les patients10. Par conséquent, il est important d'évaluer les performances diagnostiques à l'aide de méthodes standard dans notre contexte. Bien que de nombreux réactifs TAAN soient disponibles à l'Institut éthiopien de santé publique (EPHI) et dans tout le pays, aucune évaluation comparative de leur efficacité n'a encore été rapportée. Par conséquent, cette étude visait à évaluer les performances comparatives des kits disponibles dans le commerce pour la détection du SARS-CoV-2 par rRT-PCR à l’aide d’échantillons cliniques.
Au total, 164 participants suspectés d'être atteints de la COVID-19 ont été inclus dans cette étude. La majorité des échantillons provenaient de centres de traitement (118/164 = 72 %), tandis que les 46 participants restants (28 %) provenaient de centres non-traités. Parmi les participants non traités au centre, 15 (9,1 %) présentaient des cas cliniquement suspects et 31 (18,9 %) avaient des contacts de cas confirmés. Quatre-vingt-treize (56,7 %) participants étaient des hommes, et l'âge moyen (± ET) des participants était de 31,10 (± 11,82) ans.
Dans cette étude, les taux de positivité et de négativité de quatre tests de dépistage de la COVID-19 ont été déterminés. Ainsi, les taux de positivité des tests Abbott SARS-CoV-2, Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI et Sansure Biotech 2019-nCoV étaient respectivement de 59,1 %, 58,5 %, 57,9 % et 55,5 %. Les scores positifs et négatifs du standard composite de référence (SCR) étaient respectivement de 97 (59,1 %) et 67 (40,9 %) (tableau 1). Dans cette étude, la définition du CRS reposait sur la règle « tout positif », selon laquelle sur quatre résultats de test, deux résultats ou plus donnant le même résultat étaient considérés comme vrais positifs ou négatifs.
Français Dans cette étude, nous avons trouvé un pourcentage de concordance négatif (NPA) de 100 % (IC à 95 % 94,6-100) pour toutes les analyses par rapport au CRS. L'analyse de Sansure Biotechnology a montré un PPA minimal de 93,8 % (IC à 95 % 87,2-97,1) et l'analyse de Daan Gene 2019-nCoV a montré une concordance globale de 99,4 % (IC à 95 % 96,6-99,9). En revanche, la concordance globale entre le test BGI du SARS-CoV-2 et le test 2019-nCoV de Sansure Biotech était respectivement de 98,8 % et 96,3 % (Tableau 2).
Français Le coefficient kappa de concordance de Cohen entre les résultats du test CRS et ceux du test Abbott SARS-CoV-2 était entièrement cohérent (K = 1,00). De même, les valeurs kappa de Cohen détectées par Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI et Sansure Biotech 2019-nCoV sont également entièrement cohérentes avec le CRS (K ≥ 0,925). Dans cette analyse comparative, le test du chi carré (test de McNemar) a montré que les résultats du test Sansure Biotech 2019-nCoV étaient significativement différents des résultats du CRS (p = 0,031) (tableau 2).
Comme le montre la Fig.1 le pourcentage de la valeur Ct la plus basse (< 20 Ct) du test Abbott SARS-CoV-2 (gène RdRp et N combinés) était de 87,6 % et la valeur Ct du gène ORF1a/b du test Sansure Biotech 2019-nCoV a montré que le pourcentage de faible valeur Ct (< 20 Ct) était de 50,3 % et la valeur Ct élevée (36–40 Ct) était de 3,2 %. 1 le pourcentage de la valeur Ct la plus basse (< 20 Ct) du test Abbott SARS-CoV-2 (gène RdRp et N combinés) était de 87,6 % et la valeur Ct du gène ORF1a/b du test Sansure Biotech 2019-nCoV a montré que le pourcentage de faible valeur Ct (< 20 Ct) était de 50,3 % et la valeur Ct élevée (36–40 Ct) était de 3,2 %.Comme le montre la Fig.1, pour l'analyse Ct (< 20 Ct) d'Abbott SARS-CoV-2 (combiné RdRp et N) à 87,6%, pour l'analyse Ct avec ORF1a/b Sansure Biotech 2019-nCoV Le pourcentage de Ct (< 20 Ct) était de 50,3% et votre Ct (36–40 Ct) était de 3,2%. 1, le pourcentage de la valeur Ct la plus basse (< 20 Ct) analysée par Abbott SARS-CoV-2 (gène combiné RdRp et N) était de 87,6 %, et la valeur Ct de l'analyse du gène ORF1a/b de Sansure Biotech 2019-nCoV a montré que le pourcentage de faible valeur Ct (< 20 Ct) représentait 50,3 %, et la valeur Ct élevée (36–40 Ct) représentait 3,2 %.如图1 所示，Abbott SARS-CoV-2 检测（结合RdRp 和N 基因）的最低Ct 值百分比（< 20 Ct）为87.6%，Sansure Biotech 2019-nCoV pour ORF1a/b pour Ct pour Ct pour (< 20 Ct) pour 50,3 %, pour Ct pour (36–40 Ct) 3,2 %. Comme le montre la figure 1, le pourcentage de valeur Ct le plus bas (< 20 Ct) du test Abbott SARS-CoV-2 (combinaison du gène RdRp et N) est de 87,6 %, la valeur Ct du gène ORF1a/b du test Sansure Biotech 2019-nCoV montre un faible pourcentage de Ct (< 20 Ct) est de 50,3 %, le pourcentage de Ct (36–40 Ct) est de 3,2 %. En ce qui concerne le risque 1, l'analyse du SARS-CoV-2 d'Abbott (générateurs RdRp et N) est la même pour la prise en charge actuelle du Ct (< 20 Ct) dans le cadre du modèle 87,6%, à значение Ct ORF1a/b dans l'étude Sansure Biotech 2019 - Analyse du nCoV par le Ct. Comme le montre la figure 1, le test Abbott SARS-CoV-2 (combinant les gènes RdRp et N) avait la valeur de Ct en pourcentage la plus faible (< 20 Ct) à 87,6 %, tandis que la valeur Ct du gène ORF1a/b dans l'étude Sansure Biotech 2019 – L'analyse du nCoV a montré un faible Ct. Le pourcentage de (< 20 Ct) était de 50,3%, et le pourcentage de Ct (36–40 Ct) était de 3,2%. Le pourcentage de valeurs (< 20 Ct) était de 50,3 %, et le pourcentage de valeurs Ct élevées (36–40 Ct) était de 3,2 %.Le test Abbott SARS-CoV-2 B a enregistré des valeurs Ct supérieures à 30. En revanche, dans le test BGI SARS-CoV-2, le gène ORF1a/b avait une valeur Ct élevée (> 36 Ct) dont le pourcentage était de 4 % (Fig. 1). En revanche, dans le test BGI SARS-CoV-2, le gène ORF1a/b avait une valeur Ct élevée (> 36 Ct) dont le pourcentage était de 4 % (Fig. 1). Dans les magasins pharmaceutiques, dans l'analyse du BGI SARS-CoV-2, le générateur ORF1a/b a une teneur en Ct (> 36 Ct), avec une proportion de 4 % (résultat 1). En revanche, dans l'analyse du BGI, le gène ORF1a/b du SARS-CoV-2 avait une valeur Ct élevée (> 36 Ct), dont le pourcentage était de 4 % (Fig. 1).Le rapport BGI SARS-CoV-2 indique que ORF1a/b est responsable du Ct (> 36 Ct) à 4 % (1). En revanche, dans la détection du SARS-CoV-2 par BGI, le pourcentage du gène ORF1a/b avec une valeur Ct élevée (> 36 Ct) est de 4 % (Figure 1). Dans les magasins pharmaceutiques, dans l'analyse du BGI SARS-CoV-2, le pourcentage d'ORF1a/b avec vos Ct (> 36 Ct) est de 4 % (risque 1). En revanche, dans l'analyse BGI SARS-CoV-2, le pourcentage de gènes ORF1a/b avec des valeurs Ct élevées (>36 Ct) était de 4 % (Fig. 1).
Dans cette étude, nous avons prélevé 164 échantillons nasopharyngés. Pour tous les types de tests, l'isolement et l'amplification de l'ARN ont été réalisés selon les méthodes et les kits recommandés par les fabricants respectifs.
Français Cette étude a démontré que le test d'Abbott pour le SARS-CoV-2 a les mêmes performances de détection que le CRS, avec 100 % de concordance positive, négative et globale. La concordance kappa de Cohen est de 1,00, indiquant une concordance totale avec le CRS. Une étude similaire menée par l'Université de Washington aux États-Unis a révélé que la sensibilité et la spécificité globales du test d'Abbott pour le SARS-CoV-2 étaient respectivement de 93 % et 100 %, par rapport au test déterminé en laboratoire (LDA) du CDC. 11. Le système de détection du SARS-CoV-2 d'Abbott est basé sur la détection combinée simultanée des gènes N et RdRp, car les deux gènes sont plus sensibles, ce qui minimise les faux négatifs12. Une étude menée à Vienne, en Autriche, a également montré que de grands volumes d'échantillons d'extraction et d'éluants de détection minimisaient les effets de dilution et augmentaient l'efficacité de la détection13. Ainsi, la solution idéale d'Abbott pour le test SARS-CoV-2 peut être associée à un système de détection de plateforme qui détecte simultanément les gènes combinatoires, extrait un grand nombre d'échantillons (0,5 ml) et utilise une grande quantité d'éluant (40 µl).
Nos résultats ont également montré que les performances de détection du test génétique Daan étaient quasiment identiques à celles du CRS. Ceci est cohérent avec une étude14 menée à l'Université Anhui de Huainan, en Chine, et avec l'affirmation du fabricant d'une concordance positive à 100 %. Malgré des résultats cohérents, un échantillon s'est révélé faussement négatif après un nouveau test du même éluat, mais s'est avéré positif dans les tests Abbott SARS-CoV-2 et Sansure Biotech nCoV-29. Cela suggère une possible variabilité des résultats selon les différents types de tests. Néanmoins, dans l’étude réalisée en Chine15, le résultat du test du gène Daan était significativement différent (p < 0,05) par rapport à leur test de référence défini en laboratoire. Néanmoins, dans l’étude réalisée en Chine15, le résultat du test du gène Daan était significativement différent (p < 0,05) par rapport à leur test de référence défini en laboratoire. Ce n'est pas le cas, dans le cadre d'études prouvées en Chine15, l'analyse des résultats de Daan Gene a été détectée (p < 0,05) par le laboratoire et le laboratoire. analiza. Cependant, dans une étude menée en Chine15, le résultat de l’analyse de Daan Gene était significativement différent (p < 0,05) de son analyse de référence en laboratoire.然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异（p < 0,05).然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差<0,05 Ainsi, dans l'expérience, prouvée en Chine15, les résultats du test génétique de Daan ont été révélés (p < 0,05) par rapport à son moi Test du laboratoire d'essai. Cependant, dans une étude menée en Chine15, les résultats du test génétique de Daan étaient significativement différents (p < 0,05) par rapport à son test de laboratoire de référence.Cette divergence peut être due à la sensibilité du test de référence pour détecter le SARS-CoV-2, et des études supplémentaires peuvent être importantes pour en déterminer la cause.
Français De plus, notre étude a évalué les performances comparatives du test SARS-CoV-2 BGI avec le CRS, montrant une excellente concordance en pourcentage positif (PPA = 97,9 %), une concordance en pourcentage négatif (NPA = 100 %) et une concordance en pourcentage global par sexe (OPA). ). = 98,8 %). Les valeurs Kappa de Cohen ont montré une bonne concordance (K = 0,975). Des études menées aux Pays-Bas16 et en Chine15 ont montré des résultats cohérents. Le test SARS-CoV-2 BGI est un test de détection d'un seul gène (ORF1a/b) utilisant 10 µl d'éluat d'amplification/détection. Malgré une bonne concordance statistique avec nos résultats de référence, l'analyse a manqué deux échantillons positifs (1,22 %) de l'échantillon total. Cela peut avoir d'énormes implications cliniques pour la dynamique de transmission au niveau des patients et de la communauté.
Une autre analyse comparative incluse dans cette étude était le test rRT-PCR (RUO) de Sansure Biotech nCoV-2019 ; le pourcentage de correspondance global était de 96,3 %. La force de concordance a également été déterminée par la valeur Kappa de Cohen, qui était de 0,925, indiquant une concordance totale avec le CRS. Là encore, nos résultats sont identiques à ceux des études menées à l'Université Centrale du Sud de Changsha, en Chine, et au Département de laboratoire clinique de l'Hôpital populaire de Liuzhou, dans la ville de Liuzhou, en Chine17. Même si la bonne concordance statistique ci-dessus a été enregistrée, le test du chi carré (test de MacNemar) a montré que le résultat du test Sansure Biotech avait une différence statistiquement significative par rapport au CRS (p < 0,005). Même si la bonne concordance statistique ci-dessus a été enregistrée, le test du chi carré (test de MacNemar) a montré que le résultat du test Sansure Biotech avait une différence statistiquement significative par rapport au CRS (p < 0,005). Il est important de noter que le critère de votre choix (critère Macnemara) est celui qui vous intéresse le plus. Il semblerait que les résultats de l'analyse de Sansure Biotech correspondent aux statistiques relatives à la performance du CRS (p < 0,005). Bien que la bonne concordance statistique ci-dessus ait été enregistrée, le test du chi carré (test de McNemar) a montré que le résultat du test Sansure Biotech présentait une différence statistiquement significative par rapport au CRS (p < 0,005).La société Sansure Biotech a publié le communiqué de presse de Sansure Biotech.相比具有统计学显着差异（p < 0,005）。尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 ， 但 检验 （（macnemar 检验 表明 ， ， sansure biotech 检测 结果 与 crs相比 具有 显着 （（p <0.005。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。））） En ce qui concerne votre situation statistique actuelle, le critère du haut débit (critère Macnemara) a été attribué aux statistiques. значимую разницу (p < 0,005) между анализом Sansure Biotech et CRS. Malgré la bonne concordance statistique notée ci-dessus, le test du chi carré (test de McNemar) a montré une différence statistiquement significative (p < 0,005) entre le test Sansure Biotech et le CRS.Six échantillons (3,66 %) se sont révélés faussement négatifs par rapport au CRS (tableau supplémentaire 1) ; ce résultat est très important, compte tenu notamment de la dynamique de transmission du virus. Les données ci-dessus corroborent également ce faible taux de détection15.
Français Dans cette étude, les valeurs Ct ont été déterminées pour chaque test et plateforme respective, la valeur Ct moyenne la plus basse étant rapportée dans le test Abbott SARS-CoV-2. Ce résultat peut être lié au système de tests génétiques combinés simultanés d'Abbott pour la détection du SARS-CoV-2. Par conséquent, selon la figure 1, 87,6 % des résultats d'Abbott SARS-CoV-2 avaient des valeurs Ct inférieures à 20. Seul un petit nombre de résultats d'échantillons (12,4 %) étaient dans la plage 20-30. Les valeurs Ct supérieures à 30 n'ont pas été enregistrées. Outre l'utilisation par Abbott du format de test génétique du panel SARS-CoV-2, ce résultat peut être lié à la limite de détection inférieure (32,5 copies d'ARN/mL)18, qui est trois fois inférieure à la limite inférieure de la société de 100 copies d'ARN/mL. ml)19.
Cette étude présente certaines limites : premièrement, nous ne disposons pas de méthodes standard/de référence [telles que la charge virale ou d’autres tests de laboratoire (LDA)] en raison du manque de ressources. Deuxièmement, tous les échantillons utilisés dans cette étude étaient des écouvillons nasopharyngés, alors que les résultats n’étaient pas applicables à d’autres types d’échantillons ; et troisièmement, notre échantillon était de petite taille.
Cette étude a comparé les performances de quatre tests rRT-PCR pour le SARS-CoV-2 sur des échantillons nasopharyngés. Tous les tests de détection ont montré des performances quasiment comparables, à l'exception du test Sansure Biotech. De plus, le faible taux de positivité a été identifié dans le test Sansure Biotech par rapport au CRS (p < 0,05). De plus, le faible taux de positivité a été identifié dans le test Sansure Biotech par rapport au CRS (p < 0,05). En outre, lors du test Sansure Biotech, nous avons obtenu des résultats très positifs en matière de réduction du CRS (p < 0,05). De plus, le test Sansure Biotech a montré un faible pourcentage de résultats positifs par rapport au CRS (p < 0,05).Il s'agit d'une analyse de CRS et d'une analyse de Sansure Biotech (p < 0,05).Il s'agit d'une analyse de CRS et d'une analyse de Sansure Biotech (p < 0,05). En outre, l'analyse de Sansure Biotech a permis d'obtenir de très bons résultats en termes de résultats avec le CRS (p < 0,05). De plus, le test Sansure Biotech avait un taux de positivité inférieur à celui du CRS (p < 0,05).L'analyse du test Sansure Biotech nCoV-2019 (RUO) de PPA, NPA et de concordance globale a dépassé 93,5 %, avec une force de concordance Cohen Kappa de 0,925. Enfin, le test Sansure Biotech (RUO) nécessite une validation supplémentaire pour être utilisé en Éthiopie, et des recherches complémentaires devraient être envisagées pour évaluer les déclarations des différents fabricants.
L'étude comparative a été menée dans quatre établissements de santé à Addis-Abeba : l'hôpital Eka Kotebe, le centre de traitement Millennium Church, l'hôpital Zewooditu Memorial et l'hôpital spécialisé dans la tuberculose St. Peter. Les données ont été collectées entre le 1er et le 31 décembre 2020. Les établissements médicaux concernés par cette étude ont été choisis en fonction du nombre élevé de cas et de la disponibilité des principaux centres de traitement de la ville. De même, les instruments, notamment les instruments de PCR en temps réel ABI 7500 et Abbott m2000, ont été sélectionnés conformément aux recommandations des fabricants de réactifs NAAT. Quatre kits de détection PCR ont été sélectionnés pour cette étude, la plupart des laboratoires éthiopiens en utilisant au moins quatre. (Test génétique, test Abbott SARS-CoV-2, test Sansure Biotech et test globulaire sanguin SARS-CoV-2 effectués au cours de l'étude.)
Des tests de dépistage du SARS-CoV-2 ont été réalisés du 1er au 30 décembre 2020 à l'aide de 3 ml de milieu de transport viral (Miraclean Technology, Shenzhen, Chine) auprès de personnes faisant l'objet d'une investigation pour la COVID-19 et adressées à l'EPHI. Des échantillons nasopharyngés ont été prélevés par des collecteurs d'échantillons formés et envoyés à l'EPHI en triple emballage. Avant l'isolement des acides nucléiques, un numéro d'identification unique est attribué à chaque échantillon. L'extraction est effectuée dès son arrivée à l'aide de méthodes d'extraction manuelle et automatique. Ainsi, pour l'extraction automatique de l'Abbott m2000, 1,3 ml (dont 0,8 ml de volume mort et 0,5 ml de volume d'entrée d'extraction) de l'échantillon ont été extraits de chaque échantillon et passés dans le système de préparation d'échantillons d'ADN Abbott (Abbott Molecular Inc. des Plaines, IL, États-Unis). ) Un lot de 96 [92 échantillons, deux contrôles de détection et deux contrôles non modèles (NTC)] a été inclus dans le processus global (récupération et détection) de deux cycles de SARS-CoV-2 (EUA) en temps réel. De même, pour l'extraction manuelle, utilisez les mêmes échantillons (pour l'extraction et la découverte automatiques). Ainsi, tout au long du processus, 140 µl d'échantillons ont été aliquotés et extraits à l'aide du kit QIAamp Viral RNA Mini (QIAGEN GmbH, Hilden, Allemagne) par lots de 24 (dont 20 échantillons, deux contrôles d'analyse et deux NTC) sur neuf cycles. Les éluats extraits manuellement ont été amplifiés et détectés à l'aide d'un thermocycleur ABI 7500 utilisant le test SARS-CoV-2 BGI, le test Daan Gene et le test Sansure Biotech.
L'isolement et la purification automatisés de l'ARN viral du SARS-CoV-2 suivent le principe des billes magnétiques à l'aide de réactifs de préparation d'échantillons d'ADN Abbott. L'inactivation des échantillons et la solubilisation des particules virales sont réalisées à l'aide d'un détergent contenant de l'isothiocyanate de guanidine pour dénaturer la protéine et inactiver la RNase. L'ARN est ensuite séparé de la protéine par séparation en phase solide à l'aide de silice. Le sel de guanidinium et le pH alcalin du tampon de lyse favorisent la liaison des acides nucléiques à la silice (SiO2). L'étape de rinçage élimine les protéines et débris restants pour produire une solution limpide. L'ARN transparent est isolé des microparticules à base de silice grâce au champ magnétique de l'instrument20,21. D'autre part, l'isolement et la purification manuels de l'ARN sont réalisés par la méthode de la colonne de centrifugation en utilisant la centrifugation au lieu d'un support magnétique et la séparation des microparticules de l'éluant.
Français Le test de détection du SARS-CoV-2 en temps réel d'Abbott (Abbott Molecular, Inc.) a été réalisé conformément aux instructions du fabricant, qui a reçu l'EUA19,22 de l'OMS et de la FDA. Dans ce protocole, l'inactivation de l'échantillon avant l'extraction a été réalisée dans un bain-marie à 56 °C pendant 30 min. Après l'inactivation du virus, l'extraction de l'acide nucléique a été réalisée sur un instrument Abbott m2000 SP à partir de 0,5 ml de VTM en utilisant un système de préparation d'échantillons d'ADN Abbott m2000. selon le fabricant. L'amplification et la détection ont été réalisées à l'aide d'un instrument RT-PCR Abbott m2000, et une double détection a été effectuée pour les gènes RdRp et N. ROX) et VIC P (colorant exclusif) pour le ciblage et la détection des contrôles internes, permettant la détection simultanée des deux produits d'amplification 19 .
La méthode de détection de l'amplification de ce kit repose sur la technologie RT-PCR en une étape. Les gènes ORF1a/b et N ont été sélectionnés comme régions conservées par Daan Gene Technology afin de détecter l'amplification de la région cible. Des amorces et des sondes fluorescentes spécifiques (sondes du gène N marquées au FAM, sondes ORF1a/b marquées au VIC) ont été conçues pour détecter l'ARN du SARS-CoV-2 dans les échantillons. L'éluant final et les mélanges maîtres ont été préparés en ajoutant 5 µl d'éluant à 20 µl de mélange maître jusqu'à un volume final de 25 µl. L'amplification et la détection ont été réalisées simultanément sur un instrument de PCR en temps réel ABI 750024.
Les gènes ORF1a/b et N ont été détectés à l'aide du kit de diagnostic des acides nucléiques nCoV-2019 de Sansure Biotech (détection par PCR fluorescente). Préparez des sondes spécifiques pour chaque gène cible en sélectionnant le canal FAM pour la région ORF1a/b et le canal ROX pour le gène N. Ajoutez à ce kit d'analyse les réactifs éluant et master mix comme suit : préparez 30 µl de réactif master mix et 20 µl d'échantillon élué pour la détection/amplification. La PCR en temps réel ABI 750025 a été utilisée pour l'amplification/détection.
Le test BGI du SARS-CoV-2 est un kit de rRT-PCR fluorescent en temps réel pour le diagnostic de la COVID-19. La région cible est située dans la région ORF1a/b du génome du SARS-CoV-2, ce qui constitue une méthode de détection d'un seul gène. De plus, le gène de ménage humain β-actine est un gène cible régulé en interne. Le mélange maître est préparé en mélangeant 20 µl du réactif du mélange maître et 10 µl de l'échantillon d'ARN extrait dans une plaque à puits26. Un instrument de PCR quantitative en temps réel fluorescent ABI 7500 a été utilisé pour l'amplification et la détection. Toutes les amplifications d'acides nucléiques, les conditions d'exécution de la PCR pour chaque test et l'interprétation des résultats ont été réalisées conformément aux instructions du fabricant respectif (tableau 3).
Dans cette analyse comparative, nous n'avons pas utilisé la méthode de référence pour déterminer le pourcentage de concordance (positif, négatif et global) et les autres paramètres de comparaison pour les quatre analyses. Chaque comparaison de test a été effectuée avec un test de régression logistique (CRS). Dans cette étude, le CRS a été défini selon la règle « tout positif » et le résultat a été déterminé, et non par un seul test ; nous avons utilisé au moins deux résultats de tests appariés. De plus, dans le cas de la transmission de la COVID-19, les faux négatifs sont plus dangereux que les faux positifs. Par conséquent, pour qualifier un résultat de CRS de « positif » le plus précisément possible, au moins deux tests doivent être positifs, ce qui signifie qu'au moins un résultat positif est susceptible de provenir d'un test EUA. Ainsi, sur quatre résultats de test, deux ou plusieurs résultats de test donnant le même résultat sont considérés comme vrais positifs ou négatifs18,27.
Français Les données ont été collectées à l'aide de formulaires d'extraction de données structurés, la saisie et l'analyse des données ont été effectuées à l'aide du logiciel statistique Excel et de SPSS version 23.0 pour les statistiques descriptives. La concordance positive, négative et globale en pourcentage a été analysée, et un score Kappa a été utilisé pour déterminer le degré de concordance de chaque méthode avec le CRS. Les valeurs Kappa sont interprétées comme suit : 0,01 à 0,20 pour une concordance légère, 0,21 à 0,40 pour une concordance générale, 0,41-0,60 pour une concordance modérée, 0,61-0,80 pour une concordance majeure et 0,81-0,99 pour une concordance complète28.
L'Université d'Addis-Abeba a obtenu l'autorisation éthique et tous les protocoles expérimentaux de cette étude ont été approuvés par le Comité d'éthique scientifique de l'Institut éthiopien de santé publique. Le numéro de référence de la licence éthique de l'EPHI est EPHI/IRB-279-2020. Toutes les méthodes ont été appliquées conformément aux recommandations et aux dispositions des Directives nationales éthiopiennes complètes pour le traitement de la COVID-19. De plus, un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les participants à l'étude avant leur participation.
Toutes les données obtenues ou analysées dans le cadre de cette étude sont incluses dans cet article publié. Les données étayant les résultats de cette étude sont disponibles auprès de l'auteur concerné sur demande raisonnable.
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