Performance de quatre tests d'amplification d'acide nucléique pour identifier le SARS-COV-2 en Éthiopie

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Depuis l'épidémie de la maladie de la coronavirus 2019 (Covid-19), de nombreux tests d'amplification d'acide nucléique commerciaux (NAAT) ont été développés dans le monde et sont devenus des tests standard. Bien que plusieurs tests aient été rapidement développés et appliqués aux tests de diagnostic de laboratoire, les performances de ces tests n'ont pas été évaluées dans divers contextes. Par conséquent, cette étude visait à évaluer les performances des tests Abbott SARS-CoV-2, Daan Gene, BGI et Sansure Biotech en utilisant la norme de référence composite (CRS). L'étude a été menée à l'Institut de santé publique éthiopienne (EPHI) du 1 au 30 décembre 2020. 164 échantillons nasopharyngés ont été extraits à l'aide du Kit ARN QIAAmp et du système de préparation des échantillons d'ADN Abbott. Sur 164 échantillons, 59,1% étaient positifs et 40,9% étaient négatifs pour le CRS. La positivité de la biotechnologie de Sansure était significativement faible que le CRS (p <0,05). La positivité de la biotechnologie de Sansure était significativement faible que le CRS (p <0,05). Положительные реззльтаты Sansure Biotech ыли значительно ниже по сравнению с CRS (p <0,05). Les résultats positifs de Sansure Biotech étaient significativement plus faibles par rapport aux CR (P <0,05).与 CRS 相比 ， Biotech Sansure 的阳性率显着较低 （P <0,05）。与 CRS 相比 ， Biotech Sansure 的阳性率显着较低 （P <0,05）。 У Sansure Biotech ыло значительно меншше положительных резлльтатов по ср свнению с CRS (p <0,05). Sansure Biotech avait significativement moins de résultats positifs par rapport au CRS (p <0,05).L'accord global des quatre analyses était de 96,3 à 100% par rapport au CRS. En plus du faible taux de positivité du test Biotech Sansure, les performances des quatre tests étaient presque comparables. En tant que tel, le test Sansure Biotech [Research Only (RUO) nécessite une validation supplémentaire pour son utilisation en Éthiopie. Enfin, des recherches supplémentaires devraient être envisagées pour évaluer les tests avec les réclamations du fabricant approprié.
Les tests en laboratoire font partie du plan stratégique de l'Organisation mondiale de la santé (OMS) pour la préparation et la réponse de la maladie du coronavirus (Covid-19) (SPRP). Qui conseille que les pays doivent renforcer la capacité de laboratoire pour améliorer la préparation, la gestion des cas appropriée, la vigilance et la réponse rapide aux défis de santé publique. Cela suggère que le rôle du laboratoire est essentiel pour caractériser la maladie et l'épidémiologie des agents infectieux émergents et le contrôle de leur propagation.
Le diagnostic de Covid-19 nécessite des informations épidémiologiques et médicales, des symptômes / signes personnels et des données radiographiques et de laboratoire2. Depuis que l'épidémie Covid-19 a été signalée à Wuhan, en Chine, de nombreux tests d'amplification d'acide nucléique commercial (NAAT) ont été développés dans le monde. La réaction en chaîne en chaîne de la polymérase de transcription inverse en temps réel (RRT-PCR) a été utilisée comme méthode de routine et standard pour le diagnostic de laboratoire de l'infection sévère du syndrome respiratoire aiguë 2 (SARS-COV-2) 3. La détection moléculaire de SARS-COV-2 est généralement basée sur le N (gène protéique nucléocapside), E (gène de la protéine d'enveloppe) et RDRP (gène de l'ARN polymérase dépendante de l'ARN) dans ORF1A / B (cadre de lecture ouvert 1A / B). Gene) région identifiée à partir du génome viral. Ils sont considérés comme les principales régions conservées trouvées dans les génomes viraux pour la reconnaissance du virus4. Parmi ces gènes, les gènes RDRP et E ont une sensibilité à la détection analytique élevée, tandis que le gène N a une faible sensibilité analytique5.
Les performances des tests de PCR peuvent varier en fonction de divers facteurs tels que: réactifs d'extraction, réactifs d'amplification / détection, méthode d'extraction, qualité de la machine PCR et d'autres instruments. En avril 2020, plus de 48 dispositifs de diagnostic différents de neuf pays ont reçu une autorisation d'utilisation d'urgence (EUA) pour les diagnostics Covid-196. En Éthiopie, plus de 14 plateformes de PCR en temps réel sont utilisées pour la détection de PCR de SARS-COV-2 dans 26 établissements de santé publique, notamment ABI 7500, Abbott M2000, Roche 48000 et Quant-Studio7. De plus, divers kits de test de PCR sont disponibles, tels que le test du gène DAAN, le test Abbott SARS-COV-2, le test Biotech Sansure et le test BGI SARS-COV-2. Bien que le RRT-PCR soit très sensible, certains patients atteints de Covid-19 rapportent des résultats faux négatifs en raison de copies insuffisantes de l'acide ribonucléique viral (ARN) dans des échantillons en raison de la collecte, du transport, du stockage et de la manipulation et des tests de laboratoire inappropriés. Conditions et actions du personnel8. De plus, la mauvaise gestion de l'échantillon ou du contrôle, le réglage du seuil de cycle (CT) et la réactivité croisée avec d'autres acides nucléiques pathogènes ou l'ARN SARS-CoV-2 inactif / résiduel peuvent conduire à des résultats faux positifs dans les tests RRT-PCR9. Ainsi, il est clair que les tests de PCR peuvent en effet identifier les porteurs de fragments de gènes, car ils ne peuvent même pas distinguer les gènes viraux vraiment actifs, de sorte que les tests ne peuvent identifier que les porteurs et non les patients 10. Par conséquent, il est important d'évaluer les performances diagnostiques en utilisant des méthodes standard dans notre contexte. Bien que de nombreux réactifs NAAT soient disponibles à l'Institut éthiopien de santé publique (EPHI) et dans tout le pays, aucune évaluation comparative de leur efficacité n'a encore été signalée. Par conséquent, cette étude visait à évaluer les performances comparatives des kits disponibles dans le commerce pour la détection de SARS-COV-2 par RRT-PCR en utilisant des échantillons cliniques.
Au total, 164 participants avec un Covid-19 soupçonné ont été inclus dans cette étude. La majorité des échantillons provenaient de centres de traitement (118/164 = 72%), tandis que les 46 (28%) participants restants provenaient de centres de non-traitement. Parmi les participants non traités au centre, 15 (9,1%) avaient des cas suspectés cliniquement et 31 (18,9%) avaient des contacts de cas confirmés. Quatre-vingt-treize (56,7%) participants étaient des hommes et l'âge moyen (± ET) des participants était de 31,10 (± 11,82) ans.
Dans cette étude, des taux positifs et négatifs de quatre tests pour Covid-19 ont été déterminés. Ainsi, les taux positifs du test Abbott SARS-COV-2, le test Daan Gene 2019-NCOV, le test BGI SARS-COV-2 et le test Sansure Biotech 2019-NCOV étaient respectivement de 59,1%, 58,5%, 57,9% et 55,5%. Les scores de norme de référence composite positive et négative (CRS) étaient respectivement de 97 (59,1%) et 67 (40,9%) (tableau 1). Dans cette étude, la définition du CRS était basée sur la règle «n'importe quelle positive», sur laquelle sur quatre résultats de test, deux ou plusieurs résultats de test qui ont donné le même résultat ont été considérés comme un vrai positif ou négatif.
Dans cette étude, nous avons trouvé un accord de pourcentage négatif (NPA) de 100% (IC à 95% 94,6–100) pour toutes les analyses par rapport au CRS. L'analyse Sansure Biotechnology a montré un APP minimal de 93,8% (IC à 95% 87,2-97,1) et l'analyse Daan Gene 2019-NCOV avait un accord global de 99,4% (IC à 95% 96,6-99,9). En revanche, l'accord global entre le test BGI SARS-COV-2 et le test Sansure Biotech 2019-NCOV était respectivement de 98,8% et 96,3% (tableau 2).
Le coefficient d'accord Kappa de Cohen entre les résultats du test CRS et Abbott SAR-COV-2 était entièrement cohérent (k = 1,00). De même, les valeurs Kappa de Cohen détectées par Daan Gene 2019-NCOV, SARS-COV-2 BGI et Sansure Biotech 2019-NCOV sont également entièrement cohérentes avec CRS (K ≥ 0,925). Dans cette analyse comparative, le test du chi carré (test McNEMAR) a montré que les résultats du test Sansure Biotech 2019-NCOV étaient significativement différents des résultats CRS (P = 0,031) (tableau 2).
Comme le montre la Fig.1 the percentage of lowest Ct value (< 20 Ct) of Abbott SARS-CoV-2 assay (combined RdRp and N gene) was 87.6% and ORF1a/b gene Ct value of Sansure Biotech 2019-nCoV assay showed that the percentage of low Ct value (< 20 Ct) was 50.3% and the high Ct value (36–40 Ct) was 3.2%. 1 the percentage of lowest Ct value (< 20 Ct) of Abbott SARS-CoV-2 assay (combined RdRp and N gene) was 87.6% and ORF1a/b gene Ct value of Sansure Biotech 2019-nCoV assay showed that the percentage of low Ct value (< 20 Ct) was 50.3% and the high Ct value (36–40 Ct) was 3.2%.Comme le montre la Fig.1, процент наименшего значения ct (<20 ct) анализа abbott sars-coV-2 (комmine бинированный ген Rdrp и) составиnte 87%, аначччччччччч н supérie ORF1A / B анализа Sansure Biotech 2019-NCOV показало что процент низзого значения ct (<20 ct) составля 50,3%, Выыое знннilles ct (36 - 40 CT) составвля 3,2%. 1, le pourcentage de l'analyse de la valeur CT la plus basse (<20 CT) d'Abbott SARS-COV-2 (gène combiné RDRP et N) était de 87,6%, et la valeur CT de l'ORF1A / B L'analyse du gène Sansure Biotech 2019-NCOV a montré que le pourcentage de faible valeur CT (<20 CT) est comptabilisé pour 50,3% et une valeur élevée CT (36–40 ct) comptabilisée pour le 3.2%.如图 1 所示 ， ABBOTT SARS-COV-2 检测 （结合 RDRP 和 N 基因） 的最低 CT 值百分比 （<20 CT） 为 87,6% ， Sansure Biotech 2019-NCOV 检测的 ORF1A / B 基因 CT 值显示低 CT 值 (<20 ct) 的百分比为 50.3% ， 高 CT 值 (36–40 CT) 的百分比为 50.3% ， 高 Comme le montre la figure 1, le pourcentage de valeur CT le plus bas (<20 CT) du test Abbott SARS-COV-2 (combinaison du gène RDRP et N) est de 87,6%, la valeur CT du gène ORF1A / B du pourcentage Sansure Biotech 2019-NCOV montre un faible CT 值 (<20 ct) 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 CT est 50,3%, 高 CT 值 (36–40 CT) est 50,3%, 3,2%. Как показано на риннке 1, анализ Abbott Sars-Cov-2 (сочетающий гены RDRP и N) имел самое низкое п п <20 Ct) Âоое значе ние c c c <20 ct) Âооое значе ние ct (<20 ct) Â цоое значе ние ct (<20 ct) Â Â Â cооое значе ние Ct (20 Ct) Â ооое значе ние Ct (<20 Ct) Â Â ооое значе ние Ct (<20 Ct) Â цооe раззере 87,6%, а значение ct гена orf1a / b В исследовании Sansure Biotech 2019- анализ ncov показал нззeз ct. Comme le montre la figure 1, le test Abbott SARS-COV-2 (combinant les gènes RDRP et N) avait la valeur CT le plus faible (<20 CT) à 87,6%, tandis que la valeur CT du gène ORF1A / B dans l'étude Sansure Biotech 2019 - l'analyse de NCOV a montré un CT faible. Démar Le pourcentage de valeurs (<20 ct) était de 50,3% et le pourcentage de valeurs CT élevées (36–40 ct) était de 3,2%.Le test Abbott SARS-COV-2 B a enregistré des valeurs CT supérieures à 30. D'un autre côté, sur le test BGI SARS-COV-2 ORF1A / B, un pourcentage de valeur CT élevée (> 36 ct) était de 4% (Fig. 1). D'un autre côté, sur le test BGI SARS-COV-2 ORF1A / B, un pourcentage de valeur CT élevée (> 36 ct) était de 4% (Fig. 1). С друой соороны, В анализе bgi sars-cov-2 ген orf1a / b имел Высокое значение ct (> 36 ct), процент коророро ороророророророророророророророророророророророророророророророророророророророророророророророророророророророророророророророророророророророоо. D'un autre côté, dans l'analyse du gène BGI SARS-COV-2 ORF1A / B avait une valeur CT élevée (> 36 ct), dont le pourcentage était de 4% (Fig. 1).另一方面 ， 在 BGI SARS-COV-2 检测中 ， ORF1A / B 基因具有高 CT 值 （> 36 CT） 的百分比为 4% （图 1）。 En revanche, dans la détection BGI SARS-COV-2, le pourcentage du gène ORF1A / B avec une valeur CT élevée (> 36 ct) est de 4% (figure 1). С друой соороны, В анализе bgi sars-cov-2 процент генов orf1a / b с ВысокимE значенияousse CT (> 36 ct) сосаmine 4% (ри. 1). D'un autre côté, dans l'analyse BGI SARS-COV-2, le pourcentage de gènes ORF1A / B avec des valeurs CT élevées (> 36 ct) était de 4% (Fig. 1).
Dans cette étude, nous avons prélevé 164 échantillons nasopharyngés. Pour tous les types de tests, l'isolement et l'amplification de l'ARN ont été effectués en utilisant les méthodes et les kits recommandés par les fabricants respectifs.
Cette étude a démontré que le test d'Abbott pour SARS-COV-2 a les mêmes performances de détection que le CRS, avec une concordance 100% positive, négative et globale. L'accord Kappa de Cohen est de 1,00, indiquant un accord complet avec CRS. Aux États-Unis, une étude similaire de l'Université de Washington a révélé que la sensibilité globale et la spécificité du test Abbott pour le SARS-COV-2 étaient respectivement de 93% et 100% par rapport au test déterminé en laboratoire (LDA) du CDC. 11. Le système de détection Abbott SARS-COV-2 est basé sur la détection combinée simultanée des gènes N et RDRP, car les deux gènes sont plus sensibles, minimisant les faux négatifs12. Une étude à Vienne, en Autriche, a également montré que de grands volumes d'échantillonnage d'extraction et des volumes d'éluants de détection minimisent les effets de dilution et l'efficacité de détection accrue13. Ainsi, la correspondance parfaite d'Abbott pour le test SARS-COV-2 peut être associée à un système de détection de plate-forme qui détecte simultanément les gènes combinatoires, extrait un grand nombre d'échantillons (0,5 ml) et utilise une grande quantité d'éluant (40 µl).
Nos résultats ont également montré que les performances de détection du test génétique Daan étaient presque les mêmes que celles de CRS. Cela est conforme à une étude 14 réalisée à l'Université Anhui à Huainan, en Chine, et à la réclamation du fabricant d'un accord positif à 100%. Malgré les rapports de résultats cohérents, un échantillon était faux négatif après avoir retesté le même éluat, mais était positif dans les tests Abbott SARS-COV-2 et Sansure Biotech NCOV-2019. Cela suggère qu'il peut y avoir une variabilité des résultats entre différents types de tests. Néanmoins, dans l'étude réalisée en Chine15, le résultat du test du gène Daan était significativement différent (P <0,05) par rapport à leur test de référence défini en laboratoire. Néanmoins, dans l'étude réalisée en Chine15, le résultat du test du gène Daan était significativement différent (P <0,05) par rapport à leur test de référence défini en laboratoire. Тем не менеее, В исследованdent, проведенноousse лаборатоotteved Cependant, dans une étude en Chine15, le résultat de l'analyse de Daan Gene était significativement différent (p <0,05) de leur analyse de référence en laboratoire.然而 ， 在中国进行的研究中 15 ， 大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异 （P <0,05）。然而 ， 在中国进行的研究中 15 ， 大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差 <0,05 Однако В исследовании, проведенноousse сравнению с ео эталонныы лабораторныы тестом. Cependant, dans une étude en Chine15, les résultats du test génétique de Daan étaient significativement différents (P <0,05) par rapport à son test de laboratoire de référence.Cet écart peut être dû à la sensibilité du test de référence pour détecter le SARS-COV-2, et d'autres études peuvent être importantes pour déterminer la cause.
De plus, notre étude a évalué la performance comparative du test BGI SARS-COV-2 avec CRS, montrant un excellent accord de pourcentage positif (PPA = 97,9%), un accord de pourcentage négatif (NPA = 100%) et un accord de pourcentage global par sexe (OPA). ). = 98,8%). Les valeurs Kappa de Cohen ont montré un bon accord (k = 0,975). Des études aux Pays-Bas16 et China15 ont montré des résultats cohérents. Le test BGI SARS-COV-2 est un test de détection de gène (ORF1A / B) à l'aide de 10 µl d'éluat d'amplification / détection. Malgré un bon accord statistique avec nos résultats de référence, l'analyse a raté deux échantillons positifs (1,22%) de l'échantillon total. Cela peut avoir d'énormes implications cliniques pour la dynamique de transmission aux niveaux du patient et de la communauté.
Une autre analyse comparative incluse dans cette étude était le test Sansure Biotech NCOV-2019 RRT-PCR (RUO); Le pourcentage global de correspondance était de 96,3%. La force de l'accord a également été déterminée par la valeur Kappa de Cohen, qui était de 0,925, indiquant un accord complet avec le CRS. Encore une fois, nos résultats sont identiques aux études menées à l'Université Central South à Changsha, en Chine, et au département de laboratoire clinique de l'hôpital populaire de Liuzhou, dans la ville de Liuzhou, Chine17. Même si la bonne concordance statistique ci-dessus a été enregistrée, le test du chi carré (test MacNemar) a montré que le résultat du test Biotech Sansure a eu une différence statistiquement significative par rapport au CRS (p <0,005). Même si la bonne concordance statistique ci-dessus a été enregistrée, le test du chi carré (test MacNemar) a montré que le résultat du test Biotech Sansure a eu une différence statistiquement significative par rapport au CRS (p <0,005). Несотря на то, что ыыло зафиксирова cuisse (критерий макнемара) показал, что резлльтат анализа Sansure Biotech имеет статистическries 0,005). Bien que le bon accord statistique ci-dessus ait été enregistré, le test du chi carré (test McNEMAR) a montré que le résultat du test Biotech Sansure avait une différence statistiquement significative par rapport au CRS (p <0,005).尽管记录了上述良好的统计一致性 ， 但卡方检验 （macnemar 检验） 表明 ， Sansure Biotech 检测的结果与 CRS 相比具有统计学显着差异 （P <0,005）。尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 ， 但 检验 （（Macnemar 检验 表明 ， ， Sansure Biotech 检测 结果 与 CRS 相比 具有 显着 （（（P <0,005 。。。。。。。。。。。。。。。。。。。））））） Несотря на отмеченное Выше хорошее °е статистическое соответствdent, критерий хи-ваoursvi статистически значимю рзницц (p <0,005) между анализом Sansure Biotech и CRS. Malgré le bon accord statistique mentionné ci-dessus, le test du chi carré (test McNEMAR) a montré une différence statistiquement significative (p <0,005) entre le test Biotech Sansure et le CRS.Six échantillons (3,66%) se sont révélés être de faux négatifs par rapport au CRS (tableau supplémentaire 1); Ceci est très important, surtout compte tenu de la dynamique de la transmission du virus. Les données ci-dessus soutiennent également ce faible taux de détection15.
Dans cette étude, les valeurs CT ont été déterminées pour chaque essai et plate-forme respective, avec la valeur CT la plus faible rapportée dans le test Abbott SARS-COV-2. Ce résultat peut être lié au système de test génétique combiné simultané d'Abbott pour la détection de SARS-COV-2. Par conséquent, selon la figure 1, 87,6% des résultats d'Abbott SARS-COV-2 avaient des valeurs CT inférieures à 20. Seul un petit nombre de résultats d'échantillon (12,4%) se trouvaient dans la plage 20-30. Les valeurs CT supérieures à 30 n'ont pas été enregistrées. En plus de l'utilisation par Abbott du format de test génétique du panneau SARS-COV-2, ce résultat peut être lié à la limite de détection plus faible (32,5 copies d'ARN / ml) 18, ce qui est trois fois inférieur à la limite inférieure de l'entreprise de 100 copies d'ARN / ml. ml) 19.
Cette étude a certaines limites: premièrement, nous n'avons pas de méthodes standard / de référence [telles que la charge virale ou d'autres tests de laboratoire (LDA)] en raison du manque de ressources. Deuxièmement, tous les échantillons utilisés dans cette étude étaient des écouvillons nasopharyngés, tandis que les résultats n'étaient pas applicables à d'autres types d'échantillons, et troisièmement, notre taille d'échantillon était petite.
Cette étude a comparé les performances de quatre tests RRT-PCR pour SARS-COV-2 en utilisant des échantillons nasopharyngés. Tous les tests de détection avaient des performances presque comparables, à l'exception du test Biotech Sansure. En outre, le taux de positivité faible a été identifié dans le test Biotech Sansure par rapport au CRS (P <0,05). En outre, le taux de positivité faible a été identifié dans le test Biotech Sansure par rapport au CRS (P <0,05). Кроме того, В тесте Sansure Biotech ыл Вывлен низкий процент положительных резлттатов по сравнеbli р с с (p <0,05). De plus, le test de biotechnologie Sansure a montré un faible pourcentage de résultats positifs par rapport au CRS (P <0,05).此外 ， 与 CRS 相比 ， Sansure Biotech 检测的阳性率较低 (p <0,05)。此外 ， 与 CRS 相比 ， Sansure Biotech 检测的阳性率较低 (p <0,05)。 Кроме того, анализ Sansure Biotech имел болеееее ° низкий уровень положительных рзллтаtres. De plus, le test Biotech Sansure avait un taux de positivité plus faible par rapport au CRS (P <0,05).L'analyse Sansure Biotech NCOV-2019 (RUO) de l'APP, du NPA et de l'accord global a dépassé 93,5% avec une force de cohen kappa de la valeur de l'accord de 0,925. Enfin, le test Biotech Sansure (RUO) a besoin d'une validation supplémentaire pour une utilisation en Éthiopie, et des recherches supplémentaires devraient être envisagées pour évaluer les réclamations de fabricants individuels.
La conception comparative de l'étude a été menée dans quatre établissements de santé à Addis-Abeba, à l'hôpital Eka Kotebe, au Millennium Church Treatment Center, à l'hôpital Zewooditu Memorial et à l'hôpital spécialiste de la tuberculose St. Peter. Les données ont été collectées entre le 1er et le 31 décembre 2020. Les installations médicales de cette étude ont été délibérément choisies en fonction de leur nombre élevé de cas et de la disponibilité de principaux centres de traitement dans la ville. De même, les instruments, y compris les instruments de PCR ABI 7500 et Abbott M2000 en temps réel, ont été sélectionnés en fonction des recommandations des fabricants de réactifs NAAT, et quatre kits de détection de PCR ont été sélectionnés pour cette étude, car la plupart des laboratoires en Éthiopie en ont utilisé au moins au moins quatre. Le test des gènes, le test Abbott SARS-COV-2, le test de biotechnologie Sansure et le test BGI SARS-COV-2 effectué pendant l'étude).
Des tests pour le SRAS-COV-2 ont été effectués du 1 au 30 décembre 2020 en utilisant 3 ml de milieu de transport viral (VTM) (Miraclean Technology, Shenzhen, Chine) de personnes à l'étude pour Covid-19 référées à l'EPHI. Des échantillons nasopharyngés ont été prélevés par des collectionneurs d'échantillons entraînés et envoyés à Ephi en triple packs. Avant l'isolement de l'acide nucléique, chaque échantillon se voit attribuer un numéro d'identification unique. L'extraction est effectuée à partir de chaque échantillon immédiatement à l'arrivée en utilisant des méthodes d'extraction manuelles et automatiques. Ainsi, pour l'extraction automatique d'Abbott M2000, 1,3 ml (y compris 0,8 ml de volume mort et 0,5 ml de volume d'entrée d'extraction) de l'échantillon a été extrait de chaque échantillon et passé par le système de préparation de l'échantillon d'ADN Abbott (Abbott Molecular Inc. des Plaines, IL, USA). )) Un lot de 96 [92 échantillons, deux contrôles de détection et deux contrôles non modèles (NTC)] ont été inclus dans le processus global (récupération et détection) de deux cycles de SARS-COV-2 (EUA) en temps réel. exploitation minière. De même, pour l'extraction manuelle, utilisez les mêmes échantillons (pour l'extraction et la découverte automatique). Ainsi, tout au long du processus, des échantillons de 140 µl ont été aliquotés et extraits en utilisant le kit ARN viral Qiaamp Mini (Qiagen GmbH, Hilden, Allemagne) par lots de 24 (dont 20 échantillons, deux témoins de test et deux NTC) sur neuf tours. Les éluats extraits manuellement ont été amplifiés et détectés à l'aide d'un Thermal Cycler ABI 7500 en utilisant le test BGI SARS-COV-2, le test du gène Daan et le test Biotech Sansure.
L'isolement et la purification automatisées de l'ARN viral SARS-COV-2 suit le principe des billes magnétiques à l'aide des réactifs de préparation des échantillons d'ADN Abbott. L'inactivation des échantillons et la solubilisation des particules virales sont effectuées à l'aide d'un détergent contenant un isothiocyanate de guanidine pour dénaturer la protéine et inactiver la RNase. L'ARN est ensuite séparé de la protéine par séparation de phase solide en utilisant la silice, c'est-à-dire que le sel de guanidinium et le pH alcalin du tampon de lyse favorisent la liaison des acides nucléiques à la silice (SiO2). L'étape de rinçage élimine les protéines et les débris restants pour produire une solution claire. L'ARN transparent est isolé à partir de microparticules à base de silice en utilisant le champ magnétique de l'instrument20,21. D'un autre côté, l'isolement manuel et la purification de l'ARN sont effectués par la méthode de la colonne de spin en utilisant une centrifugation au lieu d'un support magnétique et une séparation des microparticules de l'éluant.
Le test de détection d'Abbott en temps réel-CoV-2 (Abbott Molecular, Inc.) a été effectué conformément aux instructions du fabricant, qui ont reçu l'EUA19,22 de l'OMS et de la FDA. Dans ce protocole, l'inactivation de l'échantillon avant l'extraction a été effectuée dans un bain-marie à 56 ° C pendant 30 min. Après inactivation du virus, l'extraction d'acide nucléique a été réalisée sur un instrument Abbott M2000 SP à partir de 0,5 ml de VTM en utilisant un système de préparation d'échantillons d'ADN Abbott M2000. Selon le fabricant. L'amplification et la détection ont été réalisées à l'aide d'un instrument RT-PCR Abbott M2000, et une détection double a été réalisée pour les gènes RDRP et N. Rox) et Vic P (colorant propriétaire) pour le ciblage et la détection des contrôles internes, permettant une détection simultanée des deux produits d'amplification 19.
La méthode de détection d'amplification de ce kit est basée sur la technologie RT-PCR en une étape. Les gènes ORF1A / B et N ont été sélectionnés comme régions conservées par la technologie des gènes Daan pour détecter l'amplification de la région cible. Des amorces spécifiques et des sondes fluorescentes (sondes de gènes N marquées avec FAM, les sondes ORF1A / B marquées avec VIC) ont été conçues pour détecter l'ARN SARS-COV-2 dans les échantillons. Les mélanges d'éluants et maîtres finaux ont été préparés en ajoutant 5 µl d'éluant à 20 µl du mélange maître à un volume final de 25 µl. L'amplification et la détection ont été effectuées simultanément sur un instrument PCR en temps réel ABI 750024.
Les gènes ORF1A / B et N ont été détectés en utilisant le kit de diagnostic d'acide nucléique Sansure Biotech NCOV-2019 (détection de PCR fluorescente). Préparez des sondes spécifiques pour chaque gène cible en sélectionnant le canal FAM pour la région ORF1A / B et le canal ROX pour le gène N. À ce kit de dosage, des réactifs d'éluants et de mélange master sont ajoutés comme suit: Préparez un réactif de mélange maître de 30 µl et un échantillon élué de 20 µl pour la détection / amplification. La PCR en temps réel ABI 750025 a été utilisée pour l'amplification / détection.
Le test BGI SARS-COV-2 est un kit RRT-PCR en temps réel fluorescent pour le diagnostic de Covid-19. La région cible est située dans la région ORF1A / B du génome SARS-COV-2, qui est une méthode de détection de gène unique. De plus, le gène ménager humain β-actine est un gène cible régulé en interne. Le mélange maître est préparé en mélangeant 20 µl du réactif de mélange maître et 10 µl de l'échantillon d'ARN extrait dans une plaque de puits26. Un instrument de PCR quantitatif en temps réel ABI 7500 a été utilisé pour l'amplification et la détection. Toutes les amplification de l'acide nucléique, les conditions de fonctionnement de la PCR pour chaque test et l'interprétation des résultats ont été effectuées en fonction des instructions du fabricant respectif (tableau 3).
Dans cette analyse comparative, nous n'avons pas utilisé la méthode de la norme de référence pour déterminer l'accord pourcentage (positif, négatif et global) et d'autres paramètres de comparaison pour les quatre analyses. Chaque comparaison de test a été effectuée avec CRS, dans cette étude, le CRS a été défini par la règle «tout positif» et le résultat a été déterminé, et non par un seul test, nous avons utilisé au moins deux résultats de test appariés. De plus, dans le cas de la transmission Covid-19, les résultats faux négatifs sont plus dangereux que les résultats de faux positifs. Par conséquent, pour dire «positif» aussi précisément que possible à partir d'un résultat CRS, au moins deux tests de test doivent être positifs, ce qui signifie qu'au moins un résultat positif est susceptible de provenir d'un test de l'UEA. Ainsi, sur quatre résultats de test, deux ou plusieurs résultats de test qui donnent le même résultat sont considérés comme un vrai positif ou négatif18,27.
Les données ont été collectées à l'aide de formulaires d'extraction de données structurés, la saisie et l'analyse des données ont été effectuées à l'aide du logiciel statistique Excel et de la version 23.0 de SPSS pour les statistiques descriptives. Un accord de pourcentage positif, négatif et global a été analysé, et un score Kappa a été utilisé pour déterminer le degré d'accord de chaque méthode avec CRS. Les valeurs Kappa sont interprétées comme suit: 0,01 à 0,20 pour un accord léger, 0,21 à 0,40 pour un accord général, 0,41-0,60 pour un accord modéré, 0,61-0,80 pour un accord majeur et 0,81-0,99 pour l'accord complet28.
Une autorisation éthique a été obtenue de l'Université d'Addis-Abeba et tous les protocoles expérimentaux pour cette étude ont été approuvés par le comité d'examen de l'éthique scientifique de l'Institut public de l'Ethiopie. Le numéro de référence de la licence d'éthique EPHI est EPHI / IRB-279-2020. Toutes les méthodes ont été appliquées conformément aux recommandations et dispositions des lignes directrices nationales éthiopiennes pour le traitement de Covid-19. De plus, un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les participants à l'étude avant la participation à l'étude.
Toutes les données obtenues ou analysées dans cette étude sont incluses dans cet article publié. Les données soutenant les résultats de cette étude sont disponibles auprès de l'auteur respectif sur demande raisonnable.
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