Performance de quatre tests d'amplification d'acide nucléique pour identifier le SRAS-CoV-2 en Éthiopie

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Depuis l’épidémie de maladie à coronavirus (COVID-19) de 2019, de nombreux tests commerciaux d’amplification des acides nucléiques (TAAN) ont été développés dans le monde entier et sont devenus des tests standards. Bien que plusieurs tests aient été rapidement développés et appliqués aux tests de diagnostic en laboratoire, leurs performances n’ont pas été évaluées dans divers contextes. Par conséquent, cette étude visait à évaluer les performances des tests Abbott SARS-CoV-2, Daan Gene, BGI et Sansure Biotech à l’aide du Composite Reference Standard (CRS). L’étude a été menée à l’Institut éthiopien de santé publique (EPHI) du 1er au 30 décembre 2020. 164 échantillons nasopharyngés ont été extraits à l’aide du mini kit QIAamp RNA et du système de préparation d’échantillons d’ADN Abbott. Sur 164 échantillons, 59,1 % étaient positifs et 40,9 % étaient négatifs pour le SRC. La positivité de Sansure Biotech était significativement faible par rapport au CRS (p < 0,05). La positivité de Sansure Biotech était significativement faible par rapport au CRS (p < 0,05). Les résultats positifs de Sansure Biotech ont été très faibles en termes de CRS (p < 0,05). Les résultats positifs de Sansure Biotech étaient significativement inférieurs à ceux de CRS (p < 0,05).Pour CRS, Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0.05）。Pour CRS, Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0.05）。 Chez Sansure Biotech, il y a des résultats très élevés en matière d'évaluation du CRS (p < 0,05). Sansure Biotech a eu significativement moins de résultats positifs que CRS (p < 0,05).La concordance globale des quatre analyses était de 96,3 à 100 % par rapport au CRS. Outre le faible taux de positivité du test Sansure Biotech, les performances des quatre tests étaient presque comparables. En tant que tel, le test Sansure Biotech [Research Only (RUO)] nécessite une validation supplémentaire pour son utilisation en Éthiopie. Enfin, des recherches supplémentaires devraient être envisagées pour évaluer les tests comportant les allégations appropriées du fabricant.
Les tests de laboratoire font partie du Plan stratégique de préparation et de réponse (SPRP) de l’Organisation mondiale de la santé (OMS) pour la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19). L'OMS conseille aux pays de renforcer les capacités des laboratoires pour améliorer la préparation, la prise en charge appropriée des cas, la vigilance et la réponse rapide aux défis de santé publique. Cela suggère que le rôle du laboratoire est essentiel pour caractériser la maladie et l’épidémiologie des agents infectieux émergents et contrôler leur propagation.
Le diagnostic de COVID-19 nécessite des informations épidémiologiques et médicales, des symptômes/signes personnels ainsi que des données radiographiques et de laboratoire2. Depuis que l’épidémie de COVID-19 a été signalée à Wuhan, en Chine, de nombreux tests commerciaux d’amplification des acides nucléiques (TAAN) ont été développés dans le monde entier. La réaction en chaîne par polymérase par transcription inverse en temps réel (rRT-PCR) a été utilisée comme méthode de routine et standard pour le diagnostic en laboratoire de l'infection par le syndrome respiratoire aigu sévère 2 (SRAS-CoV-2)3. La détection moléculaire du SRAS-CoV-2 est généralement basée sur les gènes N (gène de la protéine nucléocapside), E (gène de la protéine d'enveloppe) et RdRp (gène de l'ARN polymérase dépendant de l'ARN) dans ORF1a/b (cadre de lecture ouvert 1a/b) . gène) région identifiée à partir du génome viral. Elles sont considérées comme les principales régions conservées trouvées dans les génomes viraux pour la reconnaissance des virus4. Parmi ces gènes, les gènes RdRp et E ont une sensibilité de détection analytique élevée, tandis que le gène N a une faible sensibilité analytique5.
Les performances des tests PCR peuvent varier en fonction de divers facteurs tels que : les réactifs d'extraction, les réactifs d'amplification/détection, la méthode d'extraction, la qualité de la machine PCR et d'autres instruments. En avril 2020, plus de 48 dispositifs de diagnostic différents provenant de neuf pays avaient reçu une autorisation d'utilisation d'urgence (EUA) pour le diagnostic du COVID-196. En Éthiopie, plus de 14 plateformes PCR en temps réel sont utilisées pour la détection PCR du SRAS-CoV-2 dans 26 établissements de santé publique, dont ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000 et Quant-studio7. De plus, divers kits de tests PCR sont disponibles, tels que le test Daan Gene, le test Abbott SARS-CoV-2, le test Sansure Biotech et le test SARS-CoV-2 BGI. Bien que la rRT-PCR soit très sensible, certains patients atteints de COVID-19 signalent des résultats faussement négatifs en raison de copies insuffisantes d’acide ribonucléique (ARN) viral dans les échantillons en raison d’une collecte, d’un transport, d’un stockage et d’une manipulation inappropriés, ainsi que de tests de laboratoire. conditions et actions du personnel8. De plus, une mauvaise manipulation des échantillons ou des contrôles, le réglage du seuil de cycle (Ct) et la réactivité croisée avec d’autres acides nucléiques pathogènes ou de l’ARN du SRAS-CoV-2 inactif/résiduel peuvent conduire à des résultats faussement positifs dans les tests rRT-PCR9. Ainsi, il est clair que les tests PCR peuvent effectivement identifier les porteurs de fragments de gènes, car ils ne peuvent même pas distinguer les gènes viraux véritablement actifs, de sorte que les tests ne peuvent identifier que les porteurs et non les patients10. Par conséquent, il est important d’évaluer les performances du diagnostic à l’aide de méthodes standard dans notre contexte. Bien que de nombreux réactifs TAAN soient disponibles à l’Institut éthiopien de santé publique (EPHI) et dans tout le pays, aucune évaluation comparative de leur efficacité n’a encore été rapportée. Par conséquent, cette étude visait à évaluer les performances comparatives des kits disponibles dans le commerce pour la détection du SRAS-CoV-2 par rRT-PCR à l’aide d’échantillons cliniques.
Au total, 164 participants suspectés d’être atteints de COVID-19 ont été inclus dans cette étude. La majorité des échantillons provenaient de centres de traitement (118/164 = 72 %), tandis que les 46 participants restants (28 %) provenaient de centres autres que de traitement. Parmi les participants non traités au centre, 15 (9,1 %) avaient des cas cliniquement suspectés et 31 (18,9 %) avaient des contacts avec des cas confirmés. Quatre-vingt-treize (56,7 %) participants étaient des hommes et l'âge moyen (± écart-type) des participants était de 31,10 (± 11,82) ans.
Dans cette étude, les taux positifs et négatifs de quatre tests pour le COVID-19 ont été déterminés. Ainsi, les taux positifs du test Abbott SARS-CoV-2, du test Daan Gene 2019-nCoV, du test SARS-CoV-2 BGI et du test Sansure Biotech 2019-nCoV étaient respectivement de 59,1 %, 58,5 %, 57,9 % et 55,5 %. . Les scores positifs et négatifs des normes de référence composites (CRS) étaient respectivement de 97 (59,1 %) et 67 (40,9 %) (Tableau 1). Dans cette étude, la définition du SRC était basée sur la règle du « tout positif », selon laquelle sur quatre résultats de test, deux ou plusieurs résultats de test donnant le même résultat étaient considérés comme vraiment positifs ou négatifs.
Dans cette étude, nous avons trouvé un pourcentage de concordance négatif (NPA) de 100 % (IC à 95 % : 94,6-100) pour toutes les analyses par rapport au CRS. L'analyse Sansure Biotechnology a montré un PPA minimal de 93,8 % (IC à 95 % 87,2-97,1) et l'analyse Daan Gene 2019-nCoV avait un accord global de 99,4 % (IC à 95 % 96,6-99,9). En revanche, la concordance globale entre le test SARS-CoV-2 BGI et le test Sansure Biotech 2019-nCoV était respectivement de 98,8 % et 96,3 % (Tableau 2).
Le coefficient d'accord kappa de Cohen entre les résultats du test CRS et Abbott SARS-CoV-2 était entièrement cohérent (K = 1,00). De même, les valeurs kappa de Cohen détectées par Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI et Sansure Biotech 2019-nCoV sont également entièrement compatibles avec le CRS (K ≥ 0,925). Dans cette analyse comparative, le test du chi carré (test McNemar) a montré que les résultats du test Sansure Biotech 2019-nCoV étaient significativement différents des résultats du CRS (p = 0,031) (Tableau 2).
Comme le montre la fig.1, le pourcentage de la valeur Ct la plus basse (< 20 Ct) du test Abbott SARS-CoV-2 (gène RdRp et N combiné) était de 87,6 % et la valeur Ct du gène ORF1a/b du test Sansure Biotech 2019-nCoV a montré que le pourcentage de faible La valeur Ct (< 20 Ct) était de 50,3 % et la valeur Ct élevée (36–40 Ct) était de 3,2%. 1, le pourcentage de la valeur Ct la plus basse (< 20 Ct) du test Abbott SARS-CoV-2 (gène RdRp et N combiné) était de 87,6 % et la valeur Ct du gène ORF1a/b du test Sansure Biotech 2019-nCoV a montré que le pourcentage de faible La valeur Ct (< 20 Ct) était de 50,3 % et la valeur Ct élevée (36–40 Ct) était de 3,2%.Comme le montre la fig.1, pour l'analyse Ct (< 20 Ct) d'Abbott SARS-CoV-2 (combiné RdRp et N) à 87,6%, pour l'analyse Ct avec ORF1a/b Sansure Biotech 2019-nCoV a révélé un pourcentage élevé de Ct (< 20 Ct) à 50,3%, et votre Ct (36 à 40 Ct) à 3,2%. 1, le pourcentage de l'analyse de la valeur Ct la plus basse (< 20 Ct) d'Abbott SARS-CoV-2 (gène combiné RdRp et N) était de 87,6 %, et la valeur Ct de l'analyse du gène ORF1a/b de Sansure Biotech 2019-nCoV a montré que le pourcentage de valeur Ct faible (< 20 Ct) représentait 50,3 % et celui de valeur Ct élevée (36–40 Ct). Ct) représentait 3,2%.如图1 所示，Abbott SARS-CoV-2 检测（结合RdRp 和N 基因）的最低Ct 值百分比（< 20 Ct）为87.6%，Sansure Biotech 2019-nCoV pour ORF1a/b pour Ct pour Ct pour (< 20 Ct) pour 50,3 %, pour Ct pour (36–40 Ct)的百分比为3,2%。 Comme le montre la figure 1, le pourcentage de valeur Ct le plus bas (< 20 Ct) du test Abbott SARS-CoV-2 (combinaison du gène RdRp et N) est de 87,6 %, la valeur Ct du gène ORF1a/b du test Sansure Biotech 2019-nCoV. montre un faible pourcentage de Ct值(< 20 Ct) 的 de 50,3 %, 高Ct Le pourcentage de 值(36–40 Ct) 的 est de 3,2 %. En ce qui concerne le risque 1, l'analyse du SARS-CoV-2 d'Abbott (générateurs RdRp et N) est la même pour la prise en charge actuelle du Ct (< 20 Ct) dans le cadre du modèle 87,6%, selon l'étude Ct sur ORF1a/b dans l'étude Sansure Biotech 2019 - L'analyse du nCoV a révélé la découverte du Ct. Comme le montre la figure 1, le test Abbott SARS-CoV-2 (combinant les gènes RdRp et N) présentait le pourcentage de valeur Ct le plus faible (< 20 Ct) à 87,6 %, tandis que la valeur Ct du gène ORF1a/b dans le test Sansure Etude Biotech 2019 – L’analyse du nCoV a montré un faible Ct. Le pourcentage de (< 20 Ct) était de 50,3%, et le pourcentage de Ct (36–40 Ct) était de 3,2%. Le pourcentage de valeurs (< 20 Ct) était de 50,3 % et le pourcentage de valeurs de Ct élevées (36 à 40 Ct) était de 3,2 %.Le test Abbott SARS-CoV-2 B a enregistré des valeurs Ct supérieures à 30. D'autre part, sur le test BGI SARS-CoV-2, le gène ORF1a/b avait une valeur Ct élevée (> 36 Ct), le pourcentage était de 4 % (Fig. 1). D'autre part, sur le test BGI SARS-CoV-2, le gène ORF1a/b avait une valeur Ct élevée (> 36 Ct), le pourcentage était de 4 % (Fig. 1). Dans les magasins pharmaceutiques, dans l'analyse du BGI SARS-CoV-2, le générateur ORF1a/b a une teneur en Ct (> 36 Ct), avec une proportion de 4 % (résultat 1). En revanche, dans l'analyse du gène BGI SARS-CoV-2, ORF1a/b présentait une valeur Ct élevée (> 36 Ct), dont le pourcentage était de 4 % (Fig. 1).Le rapport BGI SARS-CoV-2 indique que ORF1a/b est responsable du Ct (> 36 Ct) à 4 % (1). D'autre part, dans la détection BGI SARS-CoV-2, le pourcentage de gène ORF1a/b avec une valeur Ct élevée (>36 Ct) est de 4 % (Figure 1). Dans les magasins pharmaceutiques, dans l'analyse du BGI SARS-CoV-2, le pourcentage d'ORF1a/b avec vos Ct (> 36 Ct) est de 4 % (risque 1). En revanche, dans l’analyse BGI SARS-CoV-2, le pourcentage de gènes ORF1a/b avec des valeurs Ct élevées (>36 Ct) était de 4 % (Fig. 1).
Dans cette étude, nous avons prélevé 164 échantillons nasopharyngés. Pour tous les types de tests, l’isolement et l’amplification de l’ARN ont été réalisés à l’aide des méthodes et kits recommandés par les fabricants respectifs.
Cette étude a démontré que le test d'Abbott pour le SRAS-CoV-2 a les mêmes performances de détection que le CRS, avec une concordance positive, négative et globale de 100 %. L'accord kappa de Cohen est de 1,00, ce qui indique un accord total avec CRS. Une étude similaire menée par l'Université de Washington aux États-Unis a révélé que la sensibilité et la spécificité globales du test Abbott pour le SRAS-CoV-2 étaient respectivement de 93 % et 100 %, par rapport au test déterminé en laboratoire (LDA) du CDC. . 11. Le système de détection Abbott SARS-CoV-2 est basé sur la détection combinée simultanée des gènes N et RdRp, car les deux gènes sont plus sensibles, minimisant ainsi les faux négatifs12. Une étude réalisée à Vienne, en Autriche, a également montré que de grands volumes d'échantillons d'extraction et d'éluant de détection minimisaient les effets de dilution et augmentaient l'efficacité de la détection13. Ainsi, la correspondance parfaite d'Abbott pour l'analyse SARS-CoV-2 peut être associée à un système de détection de plate-forme qui détecte simultanément les gènes combinatoires, extrait un grand nombre d'échantillons (0,5 ml) et utilise une grande quantité d'éluant (40 µl).
Nos résultats ont également montré que les performances de détection du test génétique Daan étaient presque les mêmes que celles du CRS. Ceci est cohérent avec une étude14 menée à l'Université d'Anhui à Huainan, en Chine, et avec l'affirmation du fabricant d'un accord positif à 100 %. Malgré les rapports faisant état de résultats cohérents, un échantillon s'est avéré faussement négatif après avoir retesté le même éluat, mais s'est avéré positif dans les tests Abbott SARS-CoV-2 et Sansure Biotech nCoV-2019. Cela suggère qu’il peut y avoir une variabilité dans les résultats selon les différents types de tests. Néanmoins, dans l’étude réalisée en Chine15, le résultat du test Daan Gene était significativement différent (p < 0,05) par rapport à leur test de référence défini en laboratoire. Néanmoins, dans l’étude réalisée en Chine15, le résultat du test Daan Gene était significativement différent (p < 0,05) par rapport à leur test de référence défini en laboratoire. Ce n'est pas le cas, dans le cadre d'études prouvées en Chine15, l'analyse des résultats de Daan Gene a été détectée (p < 0,05) par le laboratoire et le laboratoire. analyse. Cependant, dans une étude menée en Chine15, le résultat de l'analyse de Daan Gene était significativement différent (p < 0,05) de l'analyse de référence de son laboratoire.然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异（p < 0,05).然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差<0,05 Ainsi, dans l'étude, prouvée en Chine15, les résultats du test génétique de Daan ont été complètement décelés (p < 0,05) lors de la comparaison avec son entité. Test de laboratoire. Cependant, dans une étude menée en Chine15, les résultats du test génétique de Daan étaient significativement différents (p < 0,05) par rapport à son test de laboratoire de référence.Cet écart peut être dû à la sensibilité du test de référence pour détecter le SRAS-CoV-2, et des études plus approfondies peuvent être importantes pour en déterminer la cause.
De plus, notre étude a évalué les performances comparatives du test SARS-CoV-2 BGI avec le CRS, montrant un excellent pourcentage de concordance positive (PPA = 97,9 %), une concordance en pourcentage négative (NPA = 100 %) et une concordance globale en pourcentage par sexe ( OPA). ). = 98,8 %). Les valeurs Kappa de Cohen ont montré un bon accord (K = 0,975). Des études menées aux Pays-Bas16 et en Chine15 ont montré des résultats cohérents. Le test SARS-CoV-2 BGI est un test de détection d’un seul gène (ORF1a/b) utilisant 10 µl d’éluat d’amplification/détection. Malgré un bon accord statistique avec nos résultats de référence, l'analyse a manqué deux échantillons positifs (1,22 %) de l'échantillon total. Cela peut avoir d’énormes implications cliniques sur la dynamique de la transmission, tant au niveau des patients que de la communauté.
Une autre analyse comparative incluse dans cette étude était le test Sansure Biotech nCoV-2019 rRT-PCR (RUO) ; le pourcentage global de correspondance était de 96,3 %. La force de l'accord a également été déterminée par la valeur Kappa de Cohen, qui était de 0,925, indiquant un accord total avec le CRS. Encore une fois, nos résultats sont identiques à ceux des études menées à l'Université Central South à Changsha, en Chine, et au département de laboratoire clinique de l'hôpital populaire de Liuzhou, dans la ville de Liuzhou, en Chine17. Même si la bonne concordance statistique ci-dessus a été enregistrée, le test du chi carré (test de MacNemar) a montré que le résultat du test Sansure Biotech présentait une différence statistiquement significative par rapport au CRS (p < 0,005). Même si la bonne concordance statistique ci-dessus a été enregistrée, le test du chi carré (test de MacNemar) a montré que le résultat du test Sansure Biotech présentait une différence statistiquement significative par rapport au CRS (p < 0,005). Il est important de noter que le critère de votre choix (critère Macnemara) est celui qui vous intéresse le plus. Il semblerait que les résultats de l'analyse de Sansure Biotech correspondent aux statistiques relatives à la performance du CRS (p < 0,005). Bien que le bon accord statistique ci-dessus ait été enregistré, le test du chi carré (test de McNemar) a montré que le résultat du test Sansure Biotech présentait une différence statistiquement significative par rapport au CRS (p < 0,005).La société Sansure Biotech a publié le communiqué de presse de Sansure Biotech.相比具有统计学显着差异（p < 0,005）。尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 ， 但 检验 （（macnemar 检验 表明 ， ， sansure biotech 检测 结果 与 crs相比 具有 显着 （（p <0.005。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。））） En ce qui concerne votre situation statistique actuelle, le critère du haut niveau (critère Macnemara) a défini les statistiques. разницу (p < 0,005) peut être analysé par Sansure Biotech et CRS. Malgré le bon accord statistique noté ci-dessus, le test du chi carré (test de McNemar) a montré une différence statistiquement significative (p < 0,005) entre le test Sansure Biotech et le CRS.Six échantillons (3,66 %) se sont révélés faussement négatifs par rapport au CRS (tableau supplémentaire 1) ; c’est très important, surtout compte tenu de la dynamique de transmission du virus. Les données ci-dessus confirment également ce faible taux de détection15.
Dans cette étude, les valeurs Ct ont été déterminées pour chaque test et plate-forme respective, la valeur Ct moyenne la plus basse étant rapportée dans le test Abbott SARS-CoV-2. Ce résultat peut être lié au système de tests génétiques combinés simultanés d'Abbott pour la détection du SRAS-CoV-2. Par conséquent, selon la figure 1, 87,6 % des résultats Abbott SARS-CoV-2 avaient des valeurs Ct inférieures à 20. Seul un petit nombre de résultats d’échantillons (12,4 %) étaient compris entre 20 et 30. Les valeurs Ct supérieures à 30 n'ont pas été enregistrées. Outre l'utilisation par Abbott du format de test génétique du panel SARS-CoV-2, ce résultat peut être lié à la limite inférieure de détection (32,5 copies d'ARN/mL)18, qui est trois fois inférieure à la limite inférieure de 100 copies d'ARN de l'entreprise. /ml. ml)19.
Cette étude présente certaines limites : premièrement, nous ne disposons pas de méthodes standards/de référence [telles que la charge virale ou d'autres tests de laboratoire (LDA)] par manque de ressources. Deuxièmement, tous les échantillons utilisés dans cette étude étaient des écouvillons nasopharyngés, alors que les résultats n'étaient pas applicables à d'autres types d'échantillons, et troisièmement, la taille de notre échantillon était petite.
Cette étude a comparé les performances de quatre tests rRT-PCR pour le SRAS-CoV-2 à l’aide d’échantillons nasopharyngés. Tous les tests de détection avaient des performances presque comparables, à l'exception du test Sansure Biotech. En outre, le faible taux de positivité a été identifié dans le test Sansure Biotech par rapport au CRS (p < 0,05). En outre, le faible taux de positivité a été identifié dans le test Sansure Biotech par rapport au CRS (p < 0,05). En outre, lors du test Sansure Biotech, nous avons obtenu des résultats très positifs en matière de réduction du CRS (p < 0,05). De plus, le test Sansure Biotech a montré un faible pourcentage de résultats positifs par rapport au CRS (p < 0,05).Il s'agit d'une analyse de CRS et d'une analyse de Sansure Biotech (p < 0,05).Il s'agit d'une analyse de CRS et d'une analyse de Sansure Biotech (p < 0,05). En outre, l'analyse de Sansure Biotech a permis d'obtenir de très bons résultats en termes de résultats avec le CRS (p < 0,05). De plus, le test Sansure Biotech présentait un taux de positivité inférieur à celui du CRS (p < 0,05).L'analyse Sansure Biotech nCoV-2019 (RUO) du PPA, du NPA et de l'accord global a dépassé 93,5 % avec une force d'accord Cohen Kappa de 0,925. Enfin, le test Sansure Biotech (RUO) doit être validé davantage pour être utilisé en Éthiopie, et des recherches supplémentaires devraient être envisagées pour évaluer les allégations des fabricants individuels.
La conception de l'étude comparative a été menée dans quatre établissements de santé d'Addis-Abeba, l'hôpital Eka Kotebe, le centre de traitement Millennium Church, l'hôpital Zewooditu Memorial et l'hôpital spécialisé en tuberculose St. Peter. Les données ont été collectées entre le 1er et le 31 décembre 2020. Les établissements médicaux pour cette étude ont été délibérément choisis en fonction de leur nombre élevé de cas et de la disponibilité des principaux centres de traitement de la ville. De même, des instruments, notamment les instruments PCR en temps réel ABI 7500 et Abbott m2000, ont été sélectionnés conformément aux recommandations des fabricants de réactifs TAAN, et quatre kits de détection PCR ont été sélectionnés pour cette étude, car la plupart des laboratoires éthiopiens ont utilisé au moins au moins quatre d'entre eux. Test génétique, test Abbott SARS-CoV-2, test Sansure Biotech et test SARS-CoV-2 BGI effectués au cours de l'étude).
Les tests de dépistage du SRAS-CoV-2 ont été effectués du 1er au 30 décembre 2020 en utilisant 3 ml de milieu de transport viral (VTM) (Miraclean Technology, Shenzhen, Chine) auprès de personnes faisant l'objet d'une enquête pour le COVID-19 et référées à l'EPHI. Des échantillons nasopharyngés ont été collectés par des collecteurs d'échantillons qualifiés et envoyés à l'EPHI en triple pack. Avant l’isolement de l’acide nucléique, chaque échantillon se voit attribuer un numéro d’identification unique. L'extraction est effectuée à partir de chaque échantillon immédiatement après son arrivée à l'aide de méthodes d'extraction manuelles et automatiques. Ainsi, pour l'extraction automatique d'Abbott m2000, 1,3 ml (y compris 0,8 ml de volume mort et 0,5 ml de volume d'entrée d'extraction) de l'échantillon ont été extraits de chaque échantillon et passés à travers le système de préparation d'échantillons d'ADN Abbott (Abbott Molecular Inc. des Plaines, Illinois, États-Unis). ) Un lot de 96 [92 échantillons, deux contrôles de détection et deux contrôles sans modèle (NTC)] a été inclus dans le processus global (récupération et détection) de deux cycles de SARS-CoV-2 (EUA) en temps réel. exploitation minière. De même, pour l’extraction manuelle, utilisez les mêmes échantillons (pour l’extraction et la découverte automatiques). Ainsi, tout au long du processus, des échantillons de 140 µl ont été aliquotés et extraits à l’aide du mini kit QIAamp Viral RNA (QIAGEN GmbH, Hilden, Allemagne) par lots de 24 (dont 20 échantillons, deux contrôles de test et deux NTC) sur neuf cycles. Les éluats extraits manuellement ont été amplifiés et détectés à l'aide d'un thermocycleur ABI 7500 à l'aide du test SARS-CoV-2 BGI, du test Daan Gene et du test Sansure Biotech.
L'isolement et la purification automatisés de l'ARN viral du SRAS-CoV-2 suivent le principe des billes magnétiques à l'aide des réactifs de préparation d'échantillons d'ADN d'Abbott. L'inactivation des échantillons et la solubilisation des particules virales sont réalisées à l'aide d'un détergent contenant de l'isothiocyanate de guanidine pour dénaturer la protéine et inactiver la RNase. L'ARN est ensuite séparé de la protéine par séparation en phase solide à l'aide de silice, c'est à dire que le sel de guanidinium et le pH alcalin du tampon de lyse favorisent la liaison des acides nucléiques à la silice (SiO2). L'étape de rinçage élimine les protéines et les débris restants pour produire une solution claire. L'ARN transparent est isolé des microparticules à base de silice à l'aide du champ magnétique de l'instrument20,21. D'autre part, l'isolement et la purification manuels de l'ARN sont effectués par la méthode de la colonne de centrifugation utilisant la centrifugation au lieu d'un support magnétique et la séparation des microparticules de l'éluant.
Le test de détection Abbott Real-Time SARS-CoV-2 (Abbott Molecular, Inc.) a été réalisé conformément aux instructions du fabricant, qui ont reçu l'EUA19,22 de l'OMS et de la FDA. Dans ce protocole, l’inactivation de l’échantillon avant extraction a été réalisée dans un bain-marie à 56 °C pendant 30 min. Après inactivation du virus, l'extraction de l'acide nucléique a été réalisée sur un instrument Abbott m2000 SP à partir de 0,5 ml de VTM en utilisant un système de préparation d'échantillons d'ADN Abbott m2000. selon le fabricant. L'amplification et la détection ont été réalisées à l'aide d'un instrument RT-PCR Abbott m2000, et une double détection a été réalisée pour les gènes RdRp et N. ROX) et VIC P (colorant exclusif) pour le ciblage et la détection des contrôles internes, permettant la détection simultanée des deux produits d'amplification 19 .
La méthode de détection d'amplification de ce kit est basée sur la technologie RT-PCR en une étape. Les gènes ORF1a/b et N ont été sélectionnés comme régions conservées par Daan Gene Technology pour détecter l'amplification de la région cible. Des amorces spécifiques et des sondes fluorescentes (sondes du gène N marquées au FAM, sondes ORF1a/b marquées au VIC) ont été conçues pour détecter l’ARN du SRAS-CoV-2 dans les échantillons. L'éluant final et les mélanges maîtres ont été préparés en ajoutant 5 µl d'éluant à 20 µl du mélange maître pour obtenir un volume final de 25 µl. L'amplification et la détection ont été effectuées simultanément sur un instrument PCR en temps réel ABI 750024.
Les gènes ORF1a/b et N ont été détectés à l’aide du kit de diagnostic des acides nucléiques Sansure Biotech nCoV-2019 (détection par PCR fluorescente). Préparez des sondes spécifiques pour chaque gène cible en sélectionnant le canal FAM pour la région ORF1a/b et le canal ROX pour le gène N. À ce kit de test, l'éluant et les réactifs master mix sont ajoutés comme suit : préparer 30 µl de réactif master mix et 20 µl d'échantillon élué pour la détection/amplification. La PCR en temps réel ABI 750025 a été utilisée pour l'amplification/détection.
Le test SARS-CoV-2 BGI est un kit rRT-PCR fluorescent en temps réel pour le diagnostic du COVID-19. La région cible est située dans la région ORF1a/b du génome du SRAS-CoV-2, qui est une méthode de détection d'un seul gène. De plus, le gène domestique humain, la β-actine, est un gène cible régulé en interne. Le master mix est préparé en mélangeant 20 µl du réactif master mix et 10 µl de l’échantillon d’ARN extrait dans une plaque à puits26. Un instrument de PCR quantitative en temps réel fluorescent ABI 7500 a été utilisé pour l'amplification et la détection. Toutes les amplifications d'acides nucléiques, les conditions d'exécution de la PCR pour chaque test et l'interprétation des résultats ont été effectuées conformément aux instructions du fabricant respectif (Tableau 3).
Dans cette analyse comparative, nous n'avons pas utilisé la méthode standard de référence pour déterminer le pourcentage de concordance (positif, négatif et global) et d'autres paramètres de comparaison pour les quatre analyses. Chaque comparaison de tests a été effectuée avec le CRS. Dans cette étude, le CRS a été défini par la règle « tout positif » et le résultat a été déterminé, et non par un seul test, nous avons utilisé au moins deux résultats de tests appariés. De plus, dans le cas de la transmission du COVID-19, les résultats faussement négatifs sont plus dangereux que les résultats faussement positifs. Par conséquent, pour dire « positif » aussi précisément que possible à partir d’un résultat CRS, au moins deux tests doivent être positifs, ce qui signifie qu’au moins un résultat positif est susceptible de provenir d’un test EUA. Ainsi, sur quatre résultats de tests, deux ou plusieurs résultats de tests donnant le même résultat sont considérés comme vrais positifs ou négatifs18,27.
Les données ont été collectées à l'aide de formulaires d'extraction de données structurés, la saisie et l'analyse des données ont été effectuées à l'aide du logiciel statistique Excel et de SPSS version 23.0 pour les statistiques descriptives. Les pourcentages de concordance positive, négative et globale ont été analysés et un score Kappa a été utilisé pour déterminer le degré de concordance de chaque méthode avec le CRS. Les valeurs Kappa sont interprétées comme suit : 0,01 à 0,20 pour un accord léger, 0,21 à 0,40 pour un accord général, 0,41-0,60 pour un accord modéré, 0,61-0,80 pour un accord majeur et 0,81-0,99 pour un accord complet28.
L'autorisation éthique a été obtenue de l'Université d'Addis-Abeba et tous les protocoles expérimentaux de cette étude ont été approuvés par le comité d'examen de l'éthique scientifique de l'Institut éthiopien de santé publique. Le numéro de référence de la licence éthique EPHI est EPHI/IRB-279-2020. Toutes les méthodes ont été appliquées conformément aux recommandations et aux dispositions des directives nationales complètes éthiopiennes pour le traitement du COVID-19. De plus, un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les participants à l'étude avant de participer à l'étude.
Toutes les données obtenues ou analysées dans cette étude sont incluses dans cet article publié. Les données étayant les résultats de cette étude sont disponibles auprès de l'auteur respectif sur demande raisonnable.
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