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Depuis l'épidémie de maladie à coronavirus (COVID-19) de 2019, de nombreux tests commerciaux d'amplification des acides nucléiques (TAAN) ont été développés dans le monde entier et sont devenus des tests standard.Bien que plusieurs tests aient été rapidement développés et appliqués aux tests de diagnostic en laboratoire, la performance de ces tests n'a pas été évaluée dans divers contextes.Par conséquent, cette étude visait à évaluer les performances des tests Abbott SARS-CoV-2, Daan Gene, BGI et Sansure Biotech à l'aide de l'étalon de référence composite (CRS).L'étude a été menée à l'Institut éthiopien de santé publique (EPHI) du 1er au 30 décembre 2020. 164 échantillons nasopharyngés ont été extraits à l'aide du mini kit QIAamp RNA et du système de préparation d'échantillons d'ADN Abbott.Sur 164 échantillons, 59,1 % étaient positifs et 40,9 % étaient négatifs pour le SRC. La positivité de Sansure Biotech était significativement faible par rapport au CRS (p < 0,05). La positivité de Sansure Biotech était significativement faible par rapport au CRS (p < 0,05). Положительные результаты Sansure Biotech были значительно ниже по сравнению с CRS (p < 0,05). Les résultats positifs de Sansure Biotech étaient significativement inférieurs à ceux de CRS (p < 0,05).与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0.05）。与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0.05）。 У Sansure Biotech было значительно меньше положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). Sansure Biotech a eu significativement moins de résultats positifs par rapport à CRS (p < 0,05).La concordance globale des quatre analyses était de 96,3 à 100 % par rapport au CRS.En plus du faible taux de positivité du test Sansure Biotech, les performances des quatre tests étaient presque comparables.En tant que tel, le test Sansure Biotech [Research Only (RUO)] nécessite une validation supplémentaire pour son utilisation en Éthiopie.Enfin, des recherches supplémentaires doivent être envisagées pour évaluer les dosages avec les revendications appropriées du fabricant.
Les tests de laboratoire font partie du Plan stratégique de l'Organisation mondiale de la santé (OMS) pour la préparation et la réponse à la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) (SPRP).L'OMS conseille aux pays de renforcer les capacités de laboratoire pour améliorer la préparation, la prise en charge appropriée des cas, la vigilance et la réponse rapide aux problèmes de santé publique.Cela suggère que le rôle du laboratoire est essentiel pour caractériser la maladie et l'épidémiologie des agents infectieux émergents et contrôler leur propagation.
Le diagnostic de COVID-19 nécessite des informations épidémiologiques et médicales, des symptômes/signes personnels et des données radiographiques et de laboratoire2.Depuis que l'épidémie de COVID-19 a été signalée à Wuhan, en Chine, de nombreux tests commerciaux d'amplification des acides nucléiques (TAAN) ont été développés dans le monde entier.La réaction en chaîne par polymérase de transcription inverse en temps réel (rRT-PCR) a été utilisée comme méthode de routine et standard pour le diagnostic en laboratoire de l'infection par le syndrome respiratoire aigu sévère 2 (SARS-CoV-2)3.La détection moléculaire du SRAS-CoV-2 est généralement basée sur les gènes N (gène de la protéine de la nucléocapside), E (gène de la protéine de l'enveloppe) et RdRp (gène de l'ARN polymérase dépendant de l'ARN) dans ORF1a/b (cadre de lecture ouvert 1a/b) .gène) région identifiée à partir du génome viral.Elles sont considérées comme les principales régions conservées trouvées dans les génomes viraux pour la reconnaissance des virus4.Parmi ces gènes, les gènes RdRp et E ont une sensibilité de détection analytique élevée, tandis que le gène N a une faible sensibilité analytique5.
Les performances des tests PCR peuvent varier en fonction de divers facteurs tels que : les réactifs d'extraction, les réactifs d'amplification/détection, la méthode d'extraction, la qualité de la machine PCR et d'autres instruments.En avril 2020, plus de 48 appareils de diagnostic différents de neuf pays avaient reçu une autorisation d'utilisation d'urgence (EUA) pour le diagnostic du COVID-196.En Éthiopie, plus de 14 plateformes PCR en temps réel sont utilisées pour la détection PCR du SRAS-CoV-2 dans 26 établissements de santé publique, dont ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000 et Quant-studio7.De plus, divers kits de test PCR sont disponibles, tels que le test Daan Gene, le test Abbott SARS-CoV-2, le test Sansure Biotech et le test SARS-CoV-2 BGI.Bien que la rRT-PCR soit très sensible, certains patients atteints de COVID-19 signalent des résultats faussement négatifs en raison de copies insuffisantes d'acide ribonucléique viral (ARN) dans les échantillons en raison d'une collecte, d'un transport, d'un stockage et d'une manipulation inappropriés et de tests de laboratoire.conditions et actions du personnel8.De plus, une mauvaise manipulation de l'échantillon ou du contrôle, le réglage du seuil de cycle (Ct) et la réactivité croisée avec d'autres acides nucléiques pathogènes ou de l'ARN SARS-CoV-2 inactif/résiduel peuvent entraîner des résultats faussement positifs dans les tests rRT-PCR9.Ainsi, il est clair que les tests PCR peuvent effectivement identifier les porteurs de fragments de gènes, car ils ne peuvent même pas distinguer les gènes viraux réellement actifs, de sorte que les tests ne peuvent identifier que les porteurs et non les patients10.Par conséquent, il est important d'évaluer les performances de diagnostic en utilisant des méthodes standard dans notre contexte.Bien que de nombreux réactifs TAAN soient disponibles à l'Institut éthiopien de santé publique (EPHI) et dans tout le pays, aucune évaluation comparative de leur efficacité n'a encore été rapportée.Par conséquent, cette étude visait à évaluer les performances comparatives des kits disponibles dans le commerce pour la détection du SRAS-CoV-2 par rRT-PCR à l'aide d'échantillons cliniques.
Au total, 164 participants suspects de COVID-19 ont été inclus dans cette étude.La majorité des échantillons provenaient de centres de traitement (118/164 = 72%), tandis que les 46 participants restants (28%) provenaient de centres de non-traitement.Parmi les participants non traités au centre, 15 (9,1 %) avaient des cas cliniquement suspects et 31 (18,9 %) avaient des contacts de cas confirmés.Quatre-vingt-treize (56,7 %) participants étaient des hommes et l'âge moyen (± ET) des participants était de 31,10 (± 11,82) ans.
Dans cette étude, les taux positifs et négatifs de quatre tests pour COVID-19 ont été déterminés.Ainsi, les taux positifs du test Abbott SARS-CoV-2, du test Daan Gene 2019-nCoV, du test SARS-CoV-2 BGI et du test Sansure Biotech 2019-nCoV étaient respectivement de 59,1 %, 58,5 %, 57,9 % et 55,5 %. .Les scores positifs et négatifs de la norme de référence composite (CRS) étaient de 97 (59,1 %) et 67 (40,9 %), respectivement (tableau 1).Dans cette étude, la définition du SRC était basée sur la règle «tout positif», selon laquelle sur quatre résultats de test, deux résultats de test ou plus qui donnaient le même résultat étaient considérés comme vrais positifs ou négatifs.
Dans cette étude, nous avons trouvé un pourcentage de concordance négative (NPA) de 100 % (IC à 95 % 94,6-100) pour toutes les analyses par rapport au CRS.L'analyse de Sansure Biotechnology a montré un PPA minimal de 93,8 % (IC à 95 % 87,2-97,1) et l'analyse Daan Gene 2019-nCoV avait un accord global de 99,4 % (IC à 95 % 96,6-99,9).En revanche, la concordance globale entre le test SARS-CoV-2 BGI et le test Sansure Biotech 2019-nCoV était de 98,8 % et 96,3 %, respectivement (tableau 2).
Le coefficient d'accord kappa de Cohen entre les résultats du test CRS et Abbott SARS-CoV-2 était entièrement cohérent (K = 1,00).De même, les valeurs de kappa de Cohen détectées par Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI et Sansure Biotech 2019-nCoV sont également parfaitement compatibles avec le CRS (K ≥ 0,925).Dans cette analyse comparative, le test du chi carré (test de McNemar) a montré que les résultats du test Sansure Biotech 2019-nCoV étaient significativement différents des résultats du CRS (p = 0,031) (Tableau 2).
Comme le montre la Fig.1 le pourcentage de la valeur Ct la plus faible (< 20 Ct) du test Abbott SARS-CoV-2 (gène RdRp et N combiné) était de 87,6 % et la valeur Ct du gène ORF1a/b du test Sansure Biotech 2019-nCoV a montré que le pourcentage de faible La valeur Ct (< 20 Ct) était de 50,3 % et la valeur Ct élevée (36–40 Ct) était de 3,2 %. 1 le pourcentage de la valeur Ct la plus faible (< 20 Ct) du test Abbott SARS-CoV-2 (gène RdRp et N combiné) était de 87,6 % et la valeur Ct du gène ORF1a/b du test Sansure Biotech 2019-nCoV a montré que le pourcentage de faible La valeur Ct (< 20 Ct) était de 50,3 % et la valeur Ct élevée (36–40 Ct) était de 3,2 %.Comme le montre la Fig.1, процент наименьшего значения Ct (< 20 Ct) анализа Abbott SARS-CoV-2 (комбинированный ген RdRp и N) составил 87,6%, а значение Ct гена ORF1a/b анализа Sansure Biotech 2019-nCoV показало что процент низкого значения Ct (< 20 Ct) contient 50,3 %, et plus de Ct (36–40 Ct) contient 3,2 %. 1, le pourcentage de l'analyse de la valeur Ct la plus basse (< 20 Ct) d'Abbott SARS-CoV-2 (gène combiné RdRp et N) était de 87,6 %, et la valeur Ct de l'analyse du gène ORF1a/b de Sansure Biotech 2019-nCoV a montré que le pourcentage de faible valeur Ct (< 20 Ct) représentait 50,3 % et que la valeur élevée Ct (36-40 Ct) représentait 3,2 %.如 图 1 所 示 ， Abbott SARS-COV-2 检测 （结合 RDRP 和 N 基因） 的 最 低 CT 值 百分比 （<20 CT） 为 87,6% ， Sansure Biotech 2019-NCOV 检测 的 ORF1A / B 基因 CT 值 显示 低 CT值(< 20 Ct) 的百分比为50.3%，高Ct 值(36–40 Ct) 的百分比为3.2%。 Comme le montre la figure 1, le pourcentage de valeur Ct le plus bas (< 20 Ct) du test Abbott SARS-CoV-2 (combinaison du gène RdRp et N) est de 87,6 %, la valeur Ct du gène ORF1a/b du test Sansure Biotech 2019-nCoV montre un faible pourcentage de Ct值(< 20 Ct) 的 est de 50,3 %, le pourcentage de 高Ct 值(36–40 Ct) 的 est de 3,2 %. Как показано на рисунке 1, анализ Abbott SARS-CoV-2 (сочетающий гены RdRp и N) имел самое низкое процентное значение Ct (< 20 Ct) в размере 87,6%, а значение Ct гена ORF1a/b в исследовании Sansure Biotech 2019 - Анализ nCoV показал низкий Ct. Comme le montre la figure 1, le test Abbott SARS-CoV-2 (combinant les gènes RdRp et N) avait la valeur Ct en pourcentage la plus faible (< 20 Ct) à 87,6 %, tandis que la valeur Ct du gène ORF1a/b dans le Sansure Etude Biotech 2019 – L'analyse du nCoV a montré un faible Ct. Процент значений (< 20 Ct) contient 50,3%, et процент высоких значений Ct (36–40 Ct) contient 3,2%. Le pourcentage de valeurs (< 20 Ct) était de 50,3 % et le pourcentage de valeurs Ct élevées (36–40 Ct) était de 3,2 %.Le test Abbott SARS-CoV-2 B a enregistré des valeurs de Ct supérieures à 30. En revanche, sur le test BGI SARS-CoV-2, le gène ORF1a/b avait une valeur Ct élevée (> 36 Ct), le pourcentage était de 4 % (Fig. 1). En revanche, sur le test BGI SARS-CoV-2, le gène ORF1a/b avait une valeur Ct élevée (> 36 Ct), le pourcentage était de 4 % (Fig. 1). С друой соороны, В анализе bgi sars-cov-2 ген orf1a / b имел Высокое значение ct (> 36 ct), процент коророго о о осс вляpit 4% (рр. En revanche, dans l'analyse du BGI, le gène ORF1a/b du SARS-CoV-2 avait une valeur Ct élevée (> 36 Ct), dont le pourcentage était de 4 % (Fig. 1).另一方面，在BGI SARS-CoV-2 检测中，ORF1a/b 基因具有高Ct 值（> 36 Ct）的百分比为4%（图1）。 D'autre part, dans la détection BGI SARS-CoV-2, le pourcentage de gène ORF1a/b avec une valeur Ct élevée (> 36 Ct) est de 4 % (Figure 1). En plus du BGI SARS-CoV-2 et de l'ORF1a/b et du Ct (>36 Ct) et du 4 (>36 Ct). En revanche, dans l'analyse BGI SARS-CoV-2, le pourcentage de gènes ORF1a/b avec des valeurs Ct élevées (> 36 Ct) était de 4 % (Fig. 1).
Dans cette étude, nous avons prélevé 164 échantillons nasopharyngés.Pour tous les types d'essais, l'isolement et l'amplification de l'ARN ont été effectués en utilisant les méthodes et les kits recommandés par les fabricants respectifs.
Cette étude a démontré que le test d'Abbott pour le SRAS-CoV-2 a les mêmes performances de détection que le SRC, avec une concordance positive, négative et globale de 100 %.L'accord kappa de Cohen est de 1,00, indiquant un accord complet avec CRS.Une étude similaire menée par l'Université de Washington aux États-Unis a révélé que la sensibilité et la spécificité globales du test Abbott pour le SRAS-CoV-2 étaient de 93 % et 100 %, respectivement, par rapport au test déterminé en laboratoire (LDA) du CDC. .11. Le système de détection Abbott SARS-CoV-2 est basé sur la détection combinée simultanée des gènes N et RdRp, car les deux gènes sont plus sensibles, ce qui minimise les faux négatifs12.Une étude à Vienne, en Autriche, a également montré que de grands volumes d'échantillons d'extraction et d'éluants de détection minimisaient les effets de dilution et augmentaient l'efficacité de la détection13.Ainsi, la correspondance parfaite d'Abbott pour le test SARS-CoV-2 peut être associée à un système de détection de plate-forme qui détecte simultanément les gènes combinatoires, extrait un grand nombre d'échantillons (0,5 ml) et utilise une grande quantité d'éluant (40 µl).
Nos résultats ont également montré que les performances de détection du test génétique Daan étaient presque les mêmes que celles du CRS.Ceci est cohérent avec une étude14 menée à l'Université d'Anhui à Huainan, en Chine, et l'affirmation du fabricant d'un accord positif à 100 %.Malgré des rapports de résultats cohérents, un échantillon était faux négatif après avoir retesté le même éluat, mais était positif dans les tests Abbott SARS-CoV-2 et Sansure Biotech nCoV-2019.Cela suggère qu'il peut y avoir une variabilité des résultats entre les différents types de tests. Néanmoins, dans l'étude menée en Chine15, le résultat du test Daan Gene était significativement différent (p < 0,05) par rapport à leur test de référence défini en laboratoire. Néanmoins, dans l'étude menée en Chine15, le résultat du test Daan Gene était significativement différent (p < 0,05) par rapport à leur test de référence défini en laboratoire. Тем не менее, В исследовании, проведенноoupe В киаае15, рзлльттат анализа daan Gene значительно олчанана suppl. Cependant, dans une étude en Chine15, le résultat d'analyse de Daan Gene était significativement différent (p < 0,05) de leur analyse de référence en laboratoire.然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差p）0.0.<0.05 Однако в исследовании, проведенном в Китае15, результаты генетического теста Daan значительно отличались (p < 0,05) по сравнению с его эталонным лабораторным тестом. Cependant, dans une étude en Chine15, les résultats du test génétique de Daan étaient significativement différents (p < 0,05) par rapport à son test de laboratoire de référence.Cet écart peut être dû à la sensibilité du test de référence pour détecter le SRAS-CoV-2, et d'autres études peuvent être importantes pour déterminer la cause.
De plus, notre étude a évalué les performances comparatives du test SARS-CoV-2 BGI avec le CRS, montrant un excellent pourcentage de concordance positive (PPA = 97,9%), un pourcentage de concordance négatif (NPA = 100%) et un pourcentage global de concordance par sexe ( OPA).).= 98,8 %).Les valeurs Kappa de Cohen ont montré un bon accord (K = 0,975).Des études menées aux Pays-Bas16 et en Chine15 ont montré des résultats cohérents.Le test SARS-CoV-2 BGI est un test de détection d'un seul gène (ORF1a/b) utilisant 10 µl d'éluat d'amplification/détection.Malgré un bon accord statistique avec nos résultats de référence, l'analyse a manqué deux échantillons positifs (1,22 %) de l'échantillon total.Cela peut avoir d'énormes implications cliniques pour la dynamique de transmission au niveau des patients et de la communauté.
Une autre analyse comparative incluse dans cette étude était le test Sansure Biotech nCoV-2019 rRT-PCR (RUO) ;le pourcentage global de correspondance était de 96,3 %.La force de l'accord a également été déterminée par la valeur Kappa de Cohen, qui était de 0,925, indiquant un accord complet avec le CRS.Encore une fois, nos résultats sont identiques à ceux des études menées à l'Université Central South de Changsha, en Chine, et au département de laboratoire clinique de l'hôpital populaire de Liuzhou, dans la ville de Liuzhou, en Chine17. Même si la bonne concordance statistique ci-dessus a été enregistrée, le test du chi carré (test de MacNemar) a montré que le résultat du test Sansure Biotech avait une différence statistiquement significative par rapport au CRS (p < 0,005). Même si la bonne concordance statistique ci-dessus a été enregistrée, le test du chi carré (test de MacNemar) a montré que le résultat du test Sansure Biotech avait une différence statistiquement significative par rapport au CRS (p < 0,005). Несмотря на то, что было зафиксировано указанное выше хорошее статистическое соответствие, критерий хи-квадрат (критерий Макнемара) показал, что результат анализа Sansure Biotech имеет статистически значимое различие по сравнению с CRS (p < 0,005). Bien que le bon accord statistique ci-dessus ait été enregistré, le test du chi carré (test de McNemar) a montré que le résultat du test Sansure Biotech présentait une différence statistiquement significative par rapport au CRS (p < 0,005).尽管 记录 了 上述 良好 的 统计 一致性 ， 但 卡方 检验 （Macnemar 检验） 表明 ， Sansure Biotech 检测 的 结果 与 CRS 相比 具有 统计学 显着 差异 （P <0,005）。。尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致 性 ， 但 检验 （（Macnemar 检验 表明 ， ， Sansure Biotech 检测 结果 与 CRS 相比 具有 显着 （（P <0,005 。。。。。。。。。。。。。。。。 。。。）））） Несмотря на отмеченное выше хорошее статистическое соответствие, критерий хи-квадрат (критерий Макнемара) показал статистически значимую разницу (p < 0,005) между анализом Sansure Biotech и CRS. Malgré le bon accord statistique noté ci-dessus, le test du chi carré (test de McNemar) a montré une différence statistiquement significative (p < 0,005) entre le test Sansure Biotech et le CRS.Six échantillons (3,66 %) se sont révélés faux négatifs par rapport au CRS (tableau supplémentaire 1) ;c'est très important, surtout compte tenu de la dynamique de transmission du virus.Les données ci-dessus confirment également ce faible taux de détection15.
Dans cette étude, les valeurs Ct ont été déterminées pour chaque test et plateforme respective, la valeur Ct moyenne la plus basse étant rapportée dans le test Abbott SARS-CoV-2.Ce résultat peut être lié au système de test génétique combiné simultané d'Abbott pour la détection du SRAS-CoV-2.Par conséquent, selon la figure 1, 87,6 % des résultats d'Abbott SARS-CoV-2 avaient des valeurs Ct inférieures à 20. Seul un petit nombre de résultats d'échantillons (12,4 %) se situaient dans la plage 20-30.Les valeurs Ct supérieures à 30 n'ont pas été enregistrées.En plus de l'utilisation par Abbott du format de test génétique du panel SARS-CoV-2, ce résultat peut être lié à la limite de détection inférieure (32,5 copies d'ARN/mL)18, qui est trois fois inférieure à la limite inférieure de 100 copies d'ARN de l'entreprise /mL.ml)19.
Cette étude présente certaines limites : premièrement, nous ne disposons pas de méthodes standard/de référence [telles que la charge virale ou d'autres tests de laboratoire (LDA)] en raison du manque de ressources.Deuxièmement, tous les échantillons utilisés dans cette étude étaient des écouvillons nasopharyngés, alors que les résultats n'étaient pas applicables à d'autres types d'échantillons, et troisièmement, la taille de notre échantillon était petite.
Cette étude a comparé les performances de quatre tests rRT-PCR pour le SRAS-CoV-2 à l'aide d'échantillons nasopharyngés.Tous les tests de détection avaient des performances presque comparables, à l'exception du test Sansure Biotech. Par ailleurs, le faible taux de positivité a été identifié dans le test Sansure Biotech par rapport au CRS (p < 0,05). Par ailleurs, le faible taux de positivité a été identifié dans le test Sansure Biotech par rapport au CRS (p < 0,05). En tant que fournisseur, et pour Sansure Biotech, vous êtes en mesure d'utiliser votre ordinateur avec un code <RS0, <RS0, <RS0>. De plus, le test Sansure Biotech a montré un faible pourcentage de résultats positifs par rapport au CRS (p < 0,05).此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0.05)。此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0.05)。 En tant que fournisseur, l'entreprise Sansure Biotech n'est pas associée à un système de recherche sur le CRS (5 pixels). De plus, le test Sansure Biotech avait un taux de positivité inférieur à celui du CRS (p < 0,05).L'analyse Sansure Biotech nCoV-2019 (RUO) du PPA, du NPA et de la concordance globale a dépassé 93,5 % avec une force de concordance Cohen Kappa de 0,925.Enfin, le Sansure Biotech Assay (RUO) doit être validé davantage pour être utilisé en Éthiopie, et des recherches supplémentaires doivent être envisagées pour évaluer les allégations des fabricants individuels.
La conception de l'étude comparative a été menée dans quatre établissements de santé à Addis-Abeba, l'hôpital Eka Kotebe, le centre de traitement de l'église du millénaire, l'hôpital Zewooditu Memorial et l'hôpital spécialisé dans la tuberculose de St. Peter.Les données ont été recueillies entre le 1er et le 31 décembre 2020. Les installations médicales de cette étude ont été délibérément choisies en fonction de leur nombre élevé de cas et de la disponibilité des principaux centres de traitement dans la ville.De même, des instruments, y compris les instruments de PCR en temps réel ABI 7500 et Abbott m2000, ont été sélectionnés selon les recommandations des fabricants de réactifs NAAT, et quatre kits de détection PCR ont été sélectionnés pour cette étude, car la plupart des laboratoires en Éthiopie utilisaient au moins au moins Quatre d'entre eux.Test génétique, test Abbott SARS-CoV-2, test Sansure Biotech et test SARS-CoV-2 BGI réalisés au cours de l'étude).
Le dépistage du SRAS-CoV-2 a été effectué du 1er au 30 décembre 2020 en utilisant 3 ml de milieu de transport viral (VTM) (Miraclean Technology, Shenzhen, Chine) provenant de personnes sous enquête pour COVID-19 référées à l'EPHI.Des échantillons nasopharyngés ont été prélevés par des collecteurs d'échantillons formés et envoyés à l'EPHI dans des emballages triples.Avant l'isolement de l'acide nucléique, chaque échantillon se voit attribuer un numéro d'identification unique.L'extraction est effectuée à partir de chaque échantillon dès son arrivée en utilisant des méthodes d'extraction manuelles et automatiques.Ainsi, pour l'extraction automatique d'Abbott m2000, 1,3 ml (dont 0,8 ml de volume mort et 0,5 ml de volume d'entrée d'extraction) de l'échantillon ont été extraits de chaque échantillon et passés à travers le Abbott DNA Sample Preparation System (Abbott Molecular Inc. des Plaines, Illinois, États-Unis).) Un lot de 96 [92 échantillons, deux contrôles de détection et deux contrôles non modèles (NTC)] a été inclus dans le processus global (récupération et détection) de deux cycles de SARS-CoV-2 (EUA) en temps réel.exploitation minière.De même, pour l'extraction manuelle, utilisez les mêmes échantillons (pour l'extraction et la découverte automatiques).Ainsi, tout au long du processus, des échantillons de 140 µl ont été aliquotés et extraits à l'aide du kit QIAamp Viral RNA Mini (QIAGEN GmbH, Hilden, Allemagne) par lots de 24 (dont 20 échantillons, deux contrôles de dosage et deux NTC) sur neuf cycles.Les éluats extraits manuellement ont été amplifiés et détectés à l'aide d'un cycleur thermique ABI 7500 utilisant le test SARS-CoV-2 BGI, le test Daan Gene et le test Sansure Biotech.
L'isolement et la purification automatisés de l'ARN viral du SRAS-CoV-2 suivent le principe des billes magnétiques à l'aide des réactifs de préparation d'échantillons d'ADN Abbott.L'inactivation des échantillons et la solubilisation des particules virales sont réalisées à l'aide d'un détergent contenant de l'isothiocyanate de guanidine pour dénaturer la protéine et inactiver la RNase.L'ARN est ensuite séparé de la protéine par séparation en phase solide à l'aide de silice, c'est-à-dire que le sel de guanidinium et le pH alcalin du tampon de lyse favorisent la liaison des acides nucléiques à la silice (SiO2).L'étape de rinçage élimine les protéines restantes et les débris pour produire une solution claire.L'ARN transparent est isolé des microparticules à base de silice à l'aide du champ magnétique de l'instrument20,21.D'autre part, l'isolement et la purification manuels de l'ARN sont effectués par la méthode de la colonne de centrifugation en utilisant la centrifugation au lieu d'un support magnétique et la séparation des microparticules de l'éluant.
Le test de détection Abbott Real-Time SARS-CoV-2 (Abbott Molecular, Inc.) a été réalisé conformément aux instructions du fabricant, qui a reçu EUA19,22 de l'OMS et de la FDA.Dans ce protocole, l'inactivation de l'échantillon avant l'extraction a été effectuée dans un bain-marie à 56 ° C pendant 30 min.Après l'inactivation du virus, l'extraction de l'acide nucléique a été effectuée sur un instrument Abbott m2000 SP à partir de 0,5 ml de VTM en utilisant un système de préparation d'échantillons d'ADN Abbott m2000.selon le fabricant.L'amplification et la détection ont été réalisées à l'aide d'un instrument Abbott m2000 RT-PCR, et une double détection a été réalisée pour les gènes RdRp et N.ROX) et VIC P (colorant propriétaire) pour le ciblage et la détection des contrôles internes, permettant la détection simultanée des deux produits d'amplification 19 .
La méthode de détection par amplification de ce kit est basée sur la technologie RT-PCR en une étape.Les gènes ORF1a/b et N ont été sélectionnés comme régions conservées par Daan Gene Technology pour détecter l'amplification de la région cible.Des amorces spécifiques et des sondes fluorescentes (sondes du gène N marquées au FAM, sondes ORF1a/b marquées au VIC) ont été conçues pour détecter l'ARN du SARS-CoV-2 dans les échantillons.L'éluant final et les mélanges maîtres ont été préparés en ajoutant 5 µl d'éluant à 20 µl du mélange maître jusqu'à un volume final de 25 µl.L'amplification et la détection ont été effectuées simultanément sur un instrument de PCR en temps réel ABI 750024.
Les gènes ORF1a/b et N ont été détectés à l'aide du kit de diagnostic d'acide nucléique Sansure Biotech nCoV-2019 (détection par PCR fluorescente).Préparer des sondes spécifiques pour chaque gène cible en sélectionnant le canal FAM pour la région ORF1a/b et le canal ROX pour le gène N.A ce kit de test, l'éluant et les réactifs de mélange maître sont ajoutés comme suit : préparez 30 µl de réactif de mélange maître et 20 µl d'échantillon élué pour la détection/amplification.PCR en temps réel ABI 750025 a été utilisé pour l'amplification/détection.
Le test SARS-CoV-2 BGI est un kit de rRT-PCR en temps réel fluorescent pour le diagnostic du COVID-19.La région cible est située dans la région ORF1a/b du génome du SRAS-CoV-2, qui est une méthode de détection de gène unique.De plus, le gène de ménage humain β-actine est un gène cible à régulation interne.Le master mix est préparé en mélangeant 20 µl du réactif master mix et 10 µl de l'échantillon d'ARN extrait dans une plaque à puits26.Un instrument de PCR quantitative en temps réel fluorescent ABI 7500 a été utilisé pour l'amplification et la détection.Toutes les amplifications d'acides nucléiques, les conditions d'exécution de la PCR pour chaque test et l'interprétation des résultats ont été effectuées conformément aux instructions du fabricant respectif (tableau 3).
Dans cette analyse comparative, nous n'avons pas utilisé la méthode standard de référence pour déterminer le pourcentage de concordance (positif, négatif et global) et d'autres paramètres de comparaison pour les quatre analyses.Chaque comparaison de test a été effectuée avec CRS, dans cette étude, le CRS a été défini par la règle "tout positif" et le résultat a été déterminé, et non par un seul test, nous avons utilisé au moins deux résultats de test appariés.De plus, dans le cas de la transmission du COVID-19, les faux résultats négatifs sont plus dangereux que les faux résultats positifs.Par conséquent, pour dire "positif" aussi précisément que possible à partir d'un résultat de CRS, au moins deux tests de test doivent être positifs, ce qui signifie qu'au moins un résultat positif est susceptible de provenir d'un test EUA.Ainsi, sur quatre résultats de test, deux résultats de test ou plus qui donnent le même résultat sont considérés comme vrais positifs ou négatifs18,27.
Les données ont été recueillies à l'aide de formulaires d'extraction de données structurées, la saisie et l'analyse des données ont été effectuées à l'aide du logiciel statistique Excel et SPSS version 23.0 pour les statistiques descriptives.La concordance positive, négative et globale en pourcentage a été analysée, et un score Kappa a été utilisé pour déterminer le degré de concordance de chaque méthode avec le CRS.Les valeurs de Kappa sont interprétées comme suit : 0,01 à 0,20 pour un accord léger, 0,21 à 0,40 pour un accord général, 0,41-0,60 pour un accord modéré, 0,61-0,80 pour un accord majeur et 0,81-0,99 pour un accord complet28.
L'autorisation éthique a été obtenue de l'Université d'Addis-Abeba et tous les protocoles expérimentaux de cette étude ont été approuvés par le Comité d'examen de l'éthique scientifique de l'Institut éthiopien de santé publique.Le numéro de référence de la licence d'éthique EPHI est EPHI/IRB-279-2020.Toutes les méthodes ont été appliquées conformément aux recommandations et aux dispositions des directives nationales complètes éthiopiennes pour le traitement du COVID-19.De plus, un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les participants à l'étude avant leur participation à l'étude.
Toutes les données obtenues ou analysées dans cette étude sont incluses dans cet article publié.Les données à l'appui des résultats de cette étude sont disponibles auprès de l'auteur respectif sur demande raisonnable.
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Heure de publication : 08 décembre 2022