Facteurs d'interférence dans les réactions de PCR

Pendant la réaction de PCR, certains facteurs d'interférence sont souvent rencontrés.
En raison de la très forte sensibilité de la PCR, la contamination est considérée comme l'un des facteurs les plus importants affectant les résultats de la PCR et peut produire des résultats faux positifs.
Les différentes sources qui conduisent à des résultats faussement négatifs sont également critiques. Si une ou plusieurs parties essentielles du mélange de PCR ou de la réaction d'amplification elle-même sont inhibées ou interférées, le test de diagnostic peut être entravé. Cela peut entraîner une réduction de l'efficacité et même des résultats faux négatifs.
En plus de l'inhibition, la perte d'intégrité de l'acide nucléique cible peut se produire en raison des conditions d'expédition et / ou de stockage avant la préparation des échantillons. En particulier, des températures élevées ou un stockage inadéquate peuvent entraîner des dommages des cellules et des acides nucléiques. La fixation des cellules et des tissus et l'intégration de la paraffine sont des causes bien connues de fragmentation de l'ADN et un problème persistant (voir les figures 1 et 2). Dans ces cas, même l'isolement et la purification optimaux n'aideront pas.

Figure 1 | Effet de l'immobilisation sur l'intégrité de l'ADN
L'électrophorèse sur gel d'agarose a montré que la qualité de l'ADN isolé des coupes de paraffine d'autopsies variait considérablement. L'ADN de différentes longueurs de fragments moyens était présent dans les extraits en fonction de la méthode de fixation. L'ADN a été conservé uniquement lorsqu'il est fixé dans des échantillons congelés natifs et dans du formol neutre tamponné. L'utilisation d'un fixateur de bouine fortement acide ou d'un formol contenant de l'acide formique et non tamponné a entraîné une perte significative d'ADN. La fraction restante est très fragmentée.
À gauche, la longueur des fragments est exprimée en paires kilobases (KBP)

Figure 2 | Perte d'intégrité des cibles d'acide nucléique
(A) Un espace 3′-5 'sur les deux brins entraînera une rupture de l'ADN cible. La synthèse de l'ADN se produira toujours sur le petit fragment. Cependant, si un site de recuit d'amorce est manquant sur le fragment d'ADN, seule une amplification linéaire se produit. Dans le cas le plus favorable, les fragments peuvent se reproduire mutuellement, mais les rendements seront petits et inférieurs aux niveaux de détection.
(b) La perte de bases, principalement due à la dépurination et à la formation de dimères de thymidine, entraîne une diminution du nombre de liaisons H et une diminution de la TM. Pendant la phase de réchauffement allongé, les amorces se fondreont loin de l'ADN de la matrice et ne recommenceront même pas dans des conditions moins strictes.
(C) Les bases de thymine adjacentes forment un dimère TT.
Un autre problème courant qui se produit souvent dans le diagnostic moléculaire est la libération moins qu'optimale des acides nucléiques cibles par rapport à l'extraction du phénol-chloroforme. Dans les cas extrêmes, cela peut être associé à de faux négatifs. Beaucoup de temps peut être sauvé par lyse bouillante ou digestion enzymatique des débris cellulaires, mais cette méthode entraîne souvent une faible sensibilité de PCR en raison d'une libération insuffisante d'acide nucléique.

Inhibition de l'activité de la polymérase pendant l'amplification

En général, l'inhibition est utilisée comme concept de conteneur pour décrire tous les facteurs qui conduisent à des résultats de PCR sous-optimaux. Dans un sens strictement biochimique, l'inhibition est limitée à l'activité de l'enzyme, c'est-à-dire qu'elle réduit ou empêche la conversion du substrat par interaction avec le site actif de l'ADN polymérase ou son cofacteur (par exemple, Mg2 + pour l'ADN polymérase TAQ).
Les composants de l'échantillon ou divers tampons et extraits contenant des réactifs peuvent inhiber directement l'enzyme ou piéger ses cofacteurs (par exemple EDTA), inactivant ainsi la polymérase et conduisant à son tour à des résultats de PCR diminués ou fausses négatifs.
Cependant, de nombreuses interactions entre les composants de réaction et les acides nucléiques contenant la cible sont également désignées comme «inhibiteurs de PCR». Une fois que l'intégrité de la cellule est perturbée par l'isolement et que l'acide nucléique est libéré, des interactions entre l'échantillon et sa solution environnante et une phase solide peuvent se produire. Par exemple, les «charognards» peuvent se lier à l'ADN simple ou double brin par interactions non covalentes et interférer avec l'isolement et la purification en réduisant le nombre de cibles qui finissent par atteindre le vaisseau de réaction de PCR.
En général, les inhibiteurs de la PCR sont présents dans la plupart des fluides corporels et réactifs utilisés pour les tests de diagnostic clinique (urée dans l'urine, l'hémoglobine et l'héparine dans le sang), les suppléments alimentaires (composants organiques, le glycogène, les graisses, les ions Ca2 +) et les composants dans l'environnement (phénols, métaux lourds)

Des inhibiteurs de PCR plus répandus peuvent être trouvés dans les bactéries et les cellules eucaryotes, l'ADN non cible, les macromolécules de liaison à l'ADN des matrices tissulaires et des équipements de laboratoire tels que les gants et les plastiques. La purification des acides nucléiques pendant ou après l'extraction est la méthode préférée pour éliminer les inhibiteurs de la PCR.
Aujourd'hui, divers équipements d'extraction automatisés peuvent remplacer de nombreux protocoles manuels, mais une récupération et / ou une purification à 100% des cibles n'a jamais été atteinte. Des inhibiteurs potentiels peuvent encore être présents dans les acides nucléiques purifiés ou peuvent déjà avoir pris effet. Il existe différentes stratégies pour réduire l'impact des inhibiteurs. Le choix de la polymérase appropriée peut avoir un impact significatif sur l'activité des inhibiteurs. D'autres méthodes éprouvées pour réduire l'inhibition de la PCR sont une augmentation de la concentration de polymérase ou de l'application d'additifs tels que la BSA.
L'inhibition des réactions de PCR peut être démontrée par l'utilisation du contrôle de la qualité du processus interne (IPC).
Il faut prendre soin de supprimer tous les réactifs et autres solutions du kit d'extraction, tels que l'éthanol, l'EDTA, le CETAB, le licl, le guscn, le sds, l'isopropanol et le phénol, de l'isolat d'acide nucléique par une étape de lavage approfondie. Selon leur concentration, ils peuvent activer ou inhiber la PCR.