Facteurs d'interférence dans les réactions PCR

Au cours de la réaction PCR, certains facteurs interférents sont souvent rencontrés.
En raison de la très haute sensibilité de la PCR, la contamination est considérée comme l’un des facteurs les plus importants affectant les résultats de la PCR et peut produire des résultats faussement positifs.
Les différentes sources de résultats faussement négatifs sont tout aussi critiques. Si un ou plusieurs composants essentiels du mélange PCR ou la réaction d'amplification elle-même sont inhibés ou perturbés, le test diagnostique peut être perturbé. Cela peut entraîner une baisse d'efficacité, voire des résultats faussement négatifs.
Outre l'inhibition, une perte d'intégrité de l'acide nucléique cible peut survenir en raison des conditions de transport et/ou de stockage avant la préparation de l'échantillon. En particulier, des températures élevées ou un stockage inadéquat peuvent endommager les cellules et les acides nucléiques. La fixation cellulaire et tissulaire et l'inclusion en paraffine sont des causes bien connues de fragmentation de l'ADN et constituent un problème persistant (voir figures 1 et 2). Dans ces cas, même un isolement et une purification optimaux ne suffiront pas.

Figure 1 | Effet de l'immobilisation sur l'intégrité de l'ADN
L'électrophorèse sur gel d'agarose a montré que la qualité de l'ADN isolé des coupes en paraffine d'autopsies variait considérablement. Des fragments d'ADN de longueurs moyennes différentes étaient présents dans les extraits selon la méthode de fixation. L'ADN n'était préservé que lorsqu'il était fixé dans des échantillons natifs congelés et dans du formol neutre tamponné. L'utilisation d'un fixateur de Bouin fortement acide ou de formol non tamponné contenant de l'acide formique a entraîné une perte significative d'ADN. La fraction restante est très fragmentée.
À gauche, la longueur des fragments est exprimée en kilopaires de bases (kbp)

Figure 2 | Perte d'intégrité des cibles d'acides nucléiques
(a) Un espace 3'-5' sur les deux brins entraînera une rupture de l'ADN cible. La synthèse d'ADN aura toujours lieu sur le petit fragment. Cependant, si un site d'hybridation d'amorce est absent sur le fragment d'ADN, seule une amplification linéaire se produit. Dans le cas le plus favorable, les fragments peuvent se resaturer mutuellement, mais les rendements seront faibles et inférieurs aux seuils de détection.
(b) La perte de bases, principalement due à la dépurination et à la formation de dimères de thymidine, entraîne une diminution du nombre de liaisons H et une diminution de Tm. Pendant la phase de réchauffement allongée, les amorces fondront de l'ADN matriciel et ne s'hybrideront pas même dans des conditions moins strictes.
(c) Les bases thymines adjacentes forment un dimère TT.
Un autre problème fréquent en diagnostic moléculaire est la libération sous-optimale des acides nucléiques cibles par rapport à l'extraction au phénol-chloroforme. Dans les cas extrêmes, cela peut entraîner des faux négatifs. La lyse par ébullition ou la digestion enzymatique des débris cellulaires permet de gagner beaucoup de temps, mais cette méthode entraîne souvent une faible sensibilité de la PCR en raison d'une libération insuffisante des acides nucléiques.

Inhibition de l'activité polymérase lors de l'amplification

En général, l'inhibition est utilisée comme concept de conteneur pour décrire tous les facteurs conduisant à des résultats de PCR sous-optimaux. D'un point de vue strictement biochimique, l'inhibition se limite à l'activité de l'enzyme, c'est-à-dire qu'elle réduit ou empêche la conversion substrat-produit par interaction avec le site actif de l'ADN polymérase ou son cofacteur (par exemple, Mg2+ pour l'ADN polymérase Taq).
Les composants de l'échantillon ou divers tampons et extraits contenant des réactifs peuvent inhiber directement l'enzyme ou piéger ses cofacteurs (par exemple l'EDTA), inactivant ainsi la polymérase et conduisant à des résultats de PCR diminués ou faussement négatifs.
Cependant, de nombreuses interactions entre les composants de la réaction et les acides nucléiques contenant la cible sont également qualifiées d'« inhibiteurs de PCR ». Une fois l'intégrité de la cellule perturbée par l'isolement et l'acide nucléique libéré, des interactions entre l'échantillon, la solution environnante et la phase solide peuvent se produire. Par exemple, les « capteurs » peuvent se lier à l'ADN simple ou double brin par des interactions non covalentes et interférer avec l'isolement et la purification en réduisant le nombre de cibles atteignant finalement le récipient de réaction de PCR.
En général, les inhibiteurs de PCR sont présents dans la plupart des fluides corporels et des réactifs utilisés pour les tests de diagnostic clinique (urée dans l'urine, hémoglobine et héparine dans le sang), les compléments alimentaires (composants organiques, glycogène, graisses, ions Ca2+) et les composants de l'environnement (phénols, métaux lourds).

Les inhibiteurs de PCR les plus répandus se trouvent dans les bactéries et les cellules eucaryotes, l'ADN non ciblé, les macromolécules de liaison à l'ADN des matrices tissulaires et les équipements de laboratoire tels que les gants et les plastiques. La purification des acides nucléiques pendant ou après l'extraction est la méthode privilégiée pour éliminer les inhibiteurs de PCR.
Aujourd'hui, divers équipements d'extraction automatisés peuvent remplacer de nombreux protocoles manuels, mais la récupération et/ou la purification à 100 % des cibles n'ont jamais été atteintes. Des inhibiteurs potentiels peuvent encore être présents dans les acides nucléiques purifiés ou avoir déjà agi. Différentes stratégies existent pour réduire l'impact des inhibiteurs. Le choix de la polymérase appropriée peut avoir un impact significatif sur l'activité de l'inhibiteur. D'autres méthodes éprouvées pour réduire l'inhibition de la PCR consistent à augmenter la concentration de polymérase ou à appliquer des additifs tels que la BSA.
L'inhibition des réactions PCR peut être démontrée par l'utilisation d'un contrôle qualité interne du processus (IPC).
Il faut veiller à éliminer de l'isolat d'acide nucléique tous les réactifs et autres solutions du kit d'extraction, tels que l'éthanol, l'EDTA, le CETAB, le LiCl, le GuSCN, le SDS, l'isopropanol et le phénol, par un lavage minutieux. Selon leur concentration, ils peuvent activer ou inhiber la PCR.