Facteurs d'interférence dans les réactions PCR

Lors de la réaction PCR, certains facteurs interférents sont souvent rencontrés.
En raison de la très haute sensibilité de la PCR, la contamination est considérée comme l’un des facteurs les plus importants affectant les résultats de la PCR et peut produire des résultats faussement positifs.
Les différentes sources qui conduisent à des résultats faussement négatifs sont tout aussi critiques. Si une ou plusieurs parties essentielles du mélange PCR ou la réaction d'amplification elle-même sont inhibées ou perturbées, le test de diagnostic peut être entravé. Cela peut conduire à une efficacité réduite et même à des résultats faussement négatifs.
En plus de l'inhibition, une perte de l'intégrité de l'acide nucléique cible peut survenir en raison des conditions d'expédition et/ou de stockage avant la préparation de l'échantillon. En particulier, des températures élevées ou un stockage inadéquat peuvent entraîner des dommages aux cellules et aux acides nucléiques. La fixation des cellules et des tissus et l'inclusion en paraffine sont des causes bien connues de fragmentation de l'ADN et un problème persistant (voir figures 1 et 2). Dans ces cas-là, même une isolation et une purification optimales ne seront d’aucune utilité.

Figure 1 | Effet de l'immobilisation sur l'intégrité de l'ADN
L'électrophorèse sur gel d'agarose a montré que la qualité de l'ADN isolé des coupes de paraffine des autopsies variait considérablement. De l'ADN de différentes longueurs moyennes de fragments était présent dans les extraits en fonction de la méthode de fixation. L'ADN n'a été préservé que lorsqu'il a été fixé dans des échantillons natifs congelés et dans du formol neutre tamponné. L’utilisation d’un fixateur Bouin fortement acide ou de formol non tamponné contenant de l’acide formique a entraîné une perte significative d’ADN. La fraction restante est très fragmentée.
A gauche, la longueur des fragments est exprimée en paires de kilobases (kbp)

Figure 2 | Perte d'intégrité des cibles d'acide nucléique
(a) Un espace de 3′-5′ sur les deux brins entraînera une cassure de l'ADN cible. la synthèse de l'ADN se produira toujours sur le petit fragment. Cependant, s’il manque un site d’hybridation d’amorce sur le fragment d’ADN, seule une amplification linéaire se produit. Dans le cas le plus favorable, les fragments peuvent se resaturer les uns les autres, mais les rendements seront faibles et inférieurs aux niveaux de détection.
(b) La perte de bases, principalement due à la dépurination et à la formation de dimères de thymidine, entraîne une diminution du nombre de liaisons H et une diminution de la Tm. Pendant la phase de réchauffement prolongée, les amorces fondront et ne s'hybrideront pas, même dans des conditions moins strictes.
(c) Les bases de thymine adjacentes forment un dimère TT.
Un autre problème courant qui survient souvent dans le diagnostic moléculaire est la libération moins qu’optimale des acides nucléiques cibles par rapport à l’extraction au phénol-chloroforme. Dans des cas extrêmes, cela peut être associé à des faux négatifs. Beaucoup de temps peut être gagné par la lyse par ébullition ou la digestion enzymatique des débris cellulaires, mais cette méthode entraîne souvent une faible sensibilité de la PCR en raison d’une libération insuffisante d’acide nucléique.

Inhibition de l'activité polymérase pendant l'amplification

En général, l’inhibition est utilisée comme un concept conteneur pour décrire tous les facteurs qui conduisent à des résultats PCR sous-optimaux. Au sens strictement biochimique, l'inhibition est limitée à l'activité de l'enzyme, c'est-à-dire qu'elle réduit ou empêche la conversion substrat-produit par interaction avec le site actif de l'ADN polymérase ou son cofacteur (par exemple, Mg2+ pour l'ADN polymérase Taq).
Les composants de l'échantillon ou divers tampons et extraits contenant des réactifs peuvent inhiber directement l'enzyme ou piéger ses cofacteurs (par exemple l'EDTA), inactivant ainsi la polymérase et conduisant à son tour à des résultats PCR diminués ou faussement négatifs.
Cependant, de nombreuses interactions entre les composants de la réaction et les acides nucléiques contenant la cible sont également désignées comme « inhibiteurs de la PCR ». Une fois que l’intégrité de la cellule est perturbée par l’isolement et que l’acide nucléique est libéré, des interactions entre l’échantillon et sa solution environnante et sa phase solide peuvent se produire. Par exemple, les « piégeurs » peuvent se lier à l'ADN simple ou double brin par le biais d'interactions non covalentes et interférer avec l'isolement et la purification en réduisant le nombre de cibles qui finissent par atteindre le récipient de réaction PCR.
En général, les inhibiteurs de la PCR sont présents dans la plupart des fluides corporels et des réactifs utilisés pour les tests de diagnostic clinique (urée dans l'urine, hémoglobine et héparine dans le sang), les compléments alimentaires (composants organiques, glycogène, graisses, ions Ca2+) et les composants de l'environnement (phénols). , métaux lourds)

Des inhibiteurs de PCR plus répandus peuvent être trouvés dans les bactéries et les cellules eucaryotes, dans l’ADN non cible, dans les macromolécules liant l’ADN des matrices tissulaires et dans les équipements de laboratoire tels que les gants et les plastiques. La purification des acides nucléiques pendant ou après l'extraction est la méthode préférée pour éliminer les inhibiteurs de la PCR.
Aujourd’hui, divers équipements d’extraction automatisés peuvent remplacer de nombreux protocoles manuels, mais une récupération et/ou une purification à 100 % des cibles n’a jamais été atteinte. Des inhibiteurs potentiels peuvent encore être présents dans les acides nucléiques purifiés ou peuvent avoir déjà pris effet. Différentes stratégies existent pour réduire l’impact des inhibiteurs. Le choix de la polymérase appropriée peut avoir un impact significatif sur l'activité de l'inhibiteur. D'autres méthodes éprouvées pour réduire l'inhibition de la PCR consistent à augmenter la concentration de polymérase ou à appliquer des additifs tels que la BSA.
L'inhibition des réactions PCR peut être démontrée par l'utilisation d'un contrôle qualité interne du processus (IPC).
Il faut veiller à éliminer tous les réactifs et autres solutions du kit d'extraction, tels que l'éthanol, l'EDTA, le CETAB, le LiCl, le GuSCN, le SDS, l'isopropanol et le phénol, de l'isolat d'acide nucléique par une étape de lavage minutieuse. Selon leur concentration, ils peuvent activer ou inhiber la PCR.