Facteurs d'interférence dans les réactions PCR

Au cours de la réaction PCR, certains facteurs interférents sont souvent rencontrés.
En raison de la très grande sensibilité de la PCR, la contamination est considérée comme l'un des facteurs les plus importants affectant les résultats de la PCR et peut produire des résultats faussement positifs.
Tout aussi critiques sont les diverses sources qui conduisent à des résultats faussement négatifs.Si une ou plusieurs parties essentielles du mélange PCR ou la réaction d'amplification elle-même sont inhibées ou interférées, le test de diagnostic peut être entravé.Cela peut entraîner une efficacité réduite et même des résultats faussement négatifs.
En plus de l'inhibition, une perte d'intégrité de l'acide nucléique cible peut se produire en raison des conditions d'expédition et/ou de stockage avant la préparation de l'échantillon.En particulier, des températures élevées ou un stockage inadéquat peuvent endommager les cellules et les acides nucléiques.La fixation des cellules et des tissus et l'inclusion de paraffine sont des causes bien connues de fragmentation de l'ADN et un problème persistant (voir les figures 1 et 2).Dans ces cas, même une isolation et une purification optimales n'aideront pas.

Figure 1 |Effet de l'immobilisation sur l'intégrité de l'ADN
L'électrophorèse sur gel d'agarose a montré que la qualité de l'ADN isolé des coupes de paraffine des autopsies variait considérablement.L'ADN de différentes longueurs moyennes de fragments était présent dans les extraits en fonction de la méthode de fixation.L'ADN n'était conservé que lorsqu'il était fixé dans des échantillons congelés natifs et dans du formol neutre tamponné.L'utilisation d'un fixateur de Bouin fortement acide ou de formol contenant de l'acide formique non tamponné a entraîné une perte significative d'ADN.La fraction restante est très fragmentée.
A gauche, la longueur des fragments est exprimée en paires de kilobases (kbp)

Figure 2 |Perte d'intégrité des cibles d'acide nucléique
(a) Un espace 3′-5′ sur les deux brins entraînera une rupture de l'ADN cible.la synthèse d'ADN se produira toujours sur le petit fragment.Cependant, s'il manque un site d'hybridation d'amorce sur le fragment d'ADN, seule une amplification linéaire se produit.Dans le cas le plus favorable, les fragments peuvent se resaturer, mais les rendements seront faibles et inférieurs aux seuils de détection.
(b) La perte de bases, principalement due à la dépurination et à la formation de dimères de thymidine, entraîne une diminution du nombre de liaisons H et une diminution de Tm.Pendant la phase de réchauffement allongée, les amorces fondront loin de l'ADN de la matrice et ne s'hybrideront pas même dans des conditions moins strictes.
( c ) Les bases de thymine adjacentes forment un dimère TT.
Un autre problème courant qui se produit souvent dans les diagnostics moléculaires est la libération moins qu'optimale des acides nucléiques cibles par rapport à l'extraction au phénol-chloroforme.Dans les cas extrêmes, cela peut être associé à des faux négatifs.On peut gagner beaucoup de temps en faisant bouillir la lyse ou la digestion enzymatique des débris cellulaires, mais cette méthode entraîne souvent une faible sensibilité de la PCR en raison d'une libération insuffisante d'acide nucléique.

Inhibition de l'activité polymérase lors de l'amplification

En général, l'inhibition est utilisée comme concept de conteneur pour décrire tous les facteurs qui conduisent à des résultats de PCR sous-optimaux.Au sens strictement biochimique, l'inhibition est limitée à l'activité de l'enzyme, c'est-à-dire qu'elle réduit ou empêche la conversion substrat-produit par interaction avec le site actif de l'ADN polymérase ou son cofacteur (par exemple, Mg2+ pour Taq ADN polymérase).
Les composants de l'échantillon ou divers tampons et extraits contenant des réactifs peuvent inhiber directement l'enzyme ou piéger ses cofacteurs (par exemple l'EDTA), inactivant ainsi la polymérase et entraînant à son tour des résultats de PCR diminués ou faussement négatifs.
Cependant, de nombreuses interactions entre les composants de la réaction et les acides nucléiques contenant la cible sont également désignées comme « inhibiteurs de la PCR ».Une fois que l'intégrité de la cellule est perturbée par l'isolement et que l'acide nucléique est libéré, des interactions entre l'échantillon et sa solution environnante et sa phase solide peuvent se produire.Par exemple, les « charognards » peuvent se lier à l'ADN simple ou double brin par des interactions non covalentes et interférer avec l'isolement et la purification en réduisant le nombre de cibles qui finissent par atteindre le récipient de réaction PCR.
En général, les inhibiteurs de la PCR sont présents dans la plupart des fluides corporels et réactifs utilisés pour les tests de diagnostic clinique (urée dans les urines, hémoglobine et héparine dans le sang), les compléments alimentaires (composants organiques, glycogène, graisse, ions Ca2+) et les composants de l'environnement (phénols , métaux lourds)

Des inhibiteurs de PCR plus répandus peuvent être trouvés dans les bactéries et les cellules eucaryotes, l'ADN non cible, les macromolécules de liaison à l'ADN des matrices tissulaires et les équipements de laboratoire tels que les gants et les plastiques.La purification des acides nucléiques pendant ou après l'extraction est la méthode préférée pour éliminer les inhibiteurs de PCR.
Aujourd'hui, divers équipements d'extraction automatisés peuvent remplacer de nombreux protocoles manuels, mais la récupération et/ou la purification à 100 % des cibles n'ont jamais été atteintes.Des inhibiteurs potentiels peuvent encore être présents dans les acides nucléiques purifiés ou peuvent avoir déjà pris effet.Différentes stratégies existent pour réduire l'impact des inhibiteurs.Le choix de la polymérase appropriée peut avoir un impact significatif sur l'activité de l'inhibiteur.D'autres méthodes éprouvées pour réduire l'inhibition de la PCR consistent à augmenter la concentration de polymérase ou à appliquer des additifs tels que la BSA.
L'inhibition des réactions de PCR peut être démontrée par l'utilisation d'un contrôle qualité du processus interne (IPC).
Il faut veiller à éliminer tous les réactifs et autres solutions du kit d'extraction, tels que l'éthanol, l'EDTA, le CETAB, le LiCl, le GuSCN, le SDS, l'isopropanol et le phénol, de l'isolat d'acide nucléique par une étape de lavage approfondie.Selon leur concentration, ils peuvent activer ou inhiber la PCR.